高效液相色譜—串聯質譜法測定檳榔中9種有機磷農藥殘留

龔敏　梁振綱　孫慧潔

摘 要 建立檳榔中9種有機磷農藥殘留的三重四級桿液相色譜-質譜聯用分析方法，采用1%乙酸-乙腈溶液作為提取液，直接稀釋后以液相色譜-串聯質譜儀在多反應監測模式（MRM）下檢測。研究結果發現，9種有機磷農藥成分的線性范圍均在2～20 ng/mL，相關系數r均大于0.999。方法的平均回收率在73.4%～120%，RSD為0.59%～9.93%，方法檢出限為50.0 μg/kg。此方法具有良好的回收率及穩定性，可用于檳榔中有機磷農藥殘留的測定。

關鍵詞 檳榔 ；有機磷農藥 ；高效液相色譜-串聯質譜

中圖分類號 TS255.7 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.017

Abstract To establish a new method for analysis of residues of nine organophosphorus pesticides in Areca catechu Linn by using HPLC-MS-MS， one percent of acetic acid in acetonitrile was used as an extraction solvent for determination of organophosphorus pesticides by using HPLC-MS-MS. The results showed that the linear range of components of nine organophosphorus pesticides was 2～20 ng/mL with the correlation coefficient r being above 0.999. The average recovery was 73.4%～120%， and the RSD was 0.59%～9.93%. The limit of detection （LOD） was 50.0 μg/kg. This method had good stability and high recovery rate， and can be used to detect organophosphorus pesticide residues in Areca catechu Linn.

Keywords Areca catechu Linn ； organophosphorus pesticide ； HPLC-MS-MS

檳榔（Areca catechu Linn）是棕櫚科植物檳榔的種子，位列中國四大南藥之首[1]。味苦、性辛、溫，歸胃、大腸經，有殺蟲、破積、下氣、行水的功效[2]。具有驅蟲[3-4]、鎮痛、消炎、抗氧化[5]、抗病原微生物、擬膽堿[6]等藥理作用。海南是中國檳榔的主要產區，主要是以鮮果或干果供應檳榔加工企業生產檳榔嚼塊。然而2013年“檳榔致癌”風波爆發以來，海南省檳榔產業受到嚴重影響。“檳榔致癌”風波使人們更加關注檳榔的質量安全、控制和檢測。

有機磷農藥殘留是影響食用檳榔產品質量的重要因素之一，是檳榔產業鏈在種植、加工、保存環節中主要外源性有害物質之一[7-8]。目前有機磷農藥常用的檢測方式主要有氣相色譜法（GC）、氣質聯用法（GC-MS）和液質聯用法（LC-MS/MS）。有機磷農藥易氣化，且氣相色譜穩定性較好，被廣泛地用于有機磷農殘的定量檢測中[9]。為減少干擾物質的影響，通常將氣相色譜和質譜儀聯用，可以更加準確的定量和定性[10-11]。目前有機磷農藥的定性定量檢測大部分采用的是氣相色譜或氣質聯用方法。但氣相色譜的缺點是分離時間長，檢測效率不高。而高效液相色譜可以對非揮發性和熱不穩定性物質進行檢測，與質譜聯用后可以提高靈敏度，與二級質譜的聯用還可對準分子離子進行裂解，獲得豐富的結構信息，具有高效率和良好的定性、定量能力[12]。隨著多殘留檢測技術的發展，液質聯用技術越來越多地被應用于農藥殘留檢測領域[13-14]。本文針對檳榔中常見的9種有機磷農藥，采用高效液相色譜-串聯質譜聯用技術，優化色譜質譜條件，建立了檳榔中9種有機磷農藥的定性、定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

美國安捷倫公司Agilent 1200 超高效液相色譜儀、美國ABI 公司API 4000Q 四極桿質譜儀、美國Varian公司Harvard Ⅱ針泵、廣州IKA公司MS3渦旋混勻器、5810R離心機、G-285 電子天平。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、乙酸、乙酸銨（色譜純級）、甲胺磷、敵百蟲、伏殺硫磷、甲基嘧啶磷、速滅磷、殺撲磷、亞胺硫磷、治螟磷、三唑磷。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配置

有機磷農藥類標準品均購自國家標物中心，濃度為100 μg/mL。分別準確吸取各標液0.1 mL加入100 mL容量瓶，乙酸乙酯定容，得到濃度為0.1 μg/mL的9種有機磷農藥混合標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

檳榔干果，經粉碎機粉碎，剪碎其纖維，準確稱取1.00 g（精確至0.01 g）至50 mL具塞離心管中，加入20 mL 1%乙酸-乙腈，渦旋震蕩5 min，加入2 g無水硫酸鈉，渦旋混合1 min，9 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore aQ 2.1×100 mm，2.6 μm，填料為C18；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫，洗脫條件見表1。

1.2.4 質譜條件優化

離子源：電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；多反應檢測模式（MRM）模式；離子源溫度600℃；離子源電壓5 500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣，質譜優化條件見表2。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

有機磷農藥殘留檢測中常用的提取溶劑有丙酮、乙酸乙酯和乙腈，因乙酸乙酯不溶于水，不可以直接作為溶劑供液質聯用儀檢測，所以提取溶劑優先選擇丙酮和乙腈。丙酮作為提取溶劑時得到的提取液會含有更多的共萃物[15]，不易凈化，所以《食品中有機磷農藥殘留量的測定》（GB/T 2009.20-2003）和《植物源性食品中有機磷和氨基甲酸酯類農藥多種殘留的測定》（GB/T 5009.145-2003）采用丙酮作為提取溶劑的國家標準均加入了繁雜的固相萃取凈化步驟。 而乙腈作為一種極性有機溶劑，其優點是糖類、蛋白質和大多數親脂性物質不會被提取，滲透性強，對大多數有機磷農藥具有良好的溶解性。本試驗主要采用稀釋法降低基質減弱效應對檢測靈敏度的影響，達到快速、簡便和準確性高的目的，選擇乙腈作為提取溶劑，并在乙腈中添加1%乙酸作為類分析保護劑。

2.2 凈化條件的選擇

本試驗方法同時檢測了極性較大的有機磷農藥品種，如甲胺磷、敵百蟲和極性相對較小的品種，如甲基嘧啶磷等，其中甲胺磷和敵百蟲等易降解，所以給凈化方式造成了一定難度。因考慮到實驗操作時間過長對易降解農藥回收率的影響，本試驗分別考察了QuEChERS的前處理方法和直接稀釋法的凈化效果，結果表明QuEChERS中使用PSA對樣品凈化時在吸附了極性雜質的同時對甲胺磷和敵百蟲也有不同程度的吸附，而直接稀釋法雖然存在一定程度的雜質干擾和基質效應，但是在色譜圖上顯示雜質可與9種有機磷農藥的保留時間完全分離。

2.3 色譜條件的優化

分別考察了水、0.1%甲酸水溶液、0.005 mol/L乙酸銨水溶液對峰形、響應值等影響。結果表明：以甲醇-水或乙腈-水作為流動相時回收率和響應值均不高；在對0.005 mol/L乙酸銨水溶液和0.1%甲酸水溶液進行比較時發現，0.1%甲酸水溶液能讓峰形更尖銳，響應值更高。因待測液溶劑為純乙腈，在色譜分離時有溶劑效應的影響，峰形分叉，響應值低，見圖1。在變換流動相比例不能對峰形和響應值達到優化效果的情況下，本試驗嘗試降低進樣量，結果證明峰形均變得尖銳，響應值增加，見圖2。

2.4 質譜條件的確定

將9種有機磷農藥的混合標準品采用針泵直接流動注射進樣，采用正離子模式進行一級質譜分析，確定待測物的分子離子峰， 確定了待測物的分子離子質荷比后，通過碰撞氣將分子離子擊碎，碎片進入二級質譜分析，得到子離子的質譜圖。通過多反應離子檢測（MRM），選擇相對豐度較高的一組離子作為定量離子對，另一組作為定性離子對。同時對電噴霧電壓、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣流速、碰撞氣流速、離子源溫度、碰撞室出入口電壓和去簇電壓等參數進行了優化。詳見表2。

2.5 方法線性范圍、精密度和回收率試驗

準確吸取0.1 μg/mL的9種有機磷混合標準溶液20、50、80、100、200 μL，分別用基質提取液定容至1 mL，得到濃度為2、5、8、10、20 ng/mL的9中有機磷混合標準工作液。依次進樣，分別以峰面積Y為縱坐標，相應的濃度值X為橫坐標，作標準曲線。以檳榔樣品作為基質，分別對其添加低、中、高3個水平的9種有機磷農藥標樣，每個添加濃度做6個平行試驗，用于考察本方法的回收率和精密度。結果見表3。

由表3可知，9種有機磷農藥在2～20 ng/mL范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系，相關系數r均大于0.999。符合《實驗室質量控制規范》（GB/T 27404-2008）中對校準曲線的相關系數不低于0.99的要求。《實驗室質量控制規范》（GB/T 27404-2008）規定，添加水平100 μg/kg時，回收率范圍應在60%～120%，添加水平在100～1 000 μg/kg時，回收率范圍應在80%～110%。添加水平在0.1 μg/kg～1 mg/kg時，變異系數范圍應在43%～11%。由表3可知，結果符合檢測方法確認的技術要求。

2.6 樣品檢測

對海南9個市售品牌的食用檳榔樣品進行有機磷農藥殘留檢測，9個樣品均未檢出有機磷農藥殘留。試驗結果證明，試驗所用食用檳榔樣品并未非法添加甲胺磷，因有機磷農藥易降解，種植過程引入的有機磷農藥殘留可能經過食用檳榔復雜的生產加工工序完全降解。

3 結論

本試驗采用直接稀釋法對檳榔樣品進行前處理，樣品基質提取液配置標準曲線，建立了食用檳榔中9種有機磷農藥含量的液質聯用檢測方法。方法采用1%乙酸-乙腈作為提取液，提取液直接稀釋后供儀器檢測。以實際檢測時的信噪比（S/N）為3，計算本方法的檢出限為50.0 μg/kg。

結果表明，直接稀釋法是一種有效的樣品前處理方法。方法通過對提取液的稀釋，降低了干擾成分的濃度，提高待測組分離子化的競爭力，減弱基質效應。同時，方法克服了不同品種有機磷農藥因極性不同而無法同時采用吸附凈化劑的問題，適用范圍更加廣泛。相較其它的農殘分析方法，直接稀釋法具有節省溶劑、低檢測成本、操作簡便、分析速度快等優點。本研究方法提取液經過稀釋，減小基質減弱效應，譜圖中雜質峰均與待測組分峰分離。該分析方法操作簡便，效率高，準確且重現性好，適用于食用檳榔中有機磷農藥的含量測定。

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