RP—HPLC法測定凍干粉針中DHEA的含量

陳曉靜　何杰　楊建云等

[摘 要] 目的：建立反相高效液相色譜法測定凍干粉針中DHEA含量。方法：采用Diamonsil C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈-水（55：45），流速1.0 mL · min- 1；檢測波長206 nm；進樣量20 μL ；柱溫：室溫。結果：在此色譜條件下DHEA與有關物質能達到較好分離，在0.01 mg · mL- 1～

0.7 mg · mL- 1濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系， r=0.9998；方法重復性RSD為0.42%；加樣平均回收率（n=6）為98.91%。結論：該方法準確可靠，靈敏度高，專屬性好，可用于測定DHEA凍干粉針含量。

[關鍵詞] 高效液相色譜；凍干粉針；DHEA；類固醇激素

中圖分類號：R917 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2015）05-071-03

[Abstract] Objective： To establish an RP-HPLC method for determination of the content of DHEA. Methods：Diamonsil C18 （250 mm× 4.6 mm，5 μm） column was adopted ； the mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile - water （55：45） at the flow rate was 1.0 mL·min- 1 ；The ultraviolet detection wavelength was set at 206 nm； Loaded volume was 20 μL； the column temperature was room temperature. Results： DHEA and its related substances could be separated well. The linearity of DHEA was well correlated （ r=0.9998） within the range of 0.01 mg · mL- 1～0.7 mg · mL- 1. The method precision RSD was 0.42%. The average recoveries （n=6） was 98.91%. Conclusion： The method appeared to be accurate， reliable， sensitive， specific and can be used for the determination of the content of freeze-dried powder injection DHEA .

[Key words] HPLC；freeze-dried powder injection；DHEA； steroid hormone

引言

DHEA（脫氫表雄酮，dehydroepiandrosterone）為腎上腺及性腺分泌的一種類固醇激素，經大量研究發現，DHEA具抗衰老、預防心血管疾患、改善記憶、增強免疫力作用[1～2]，對小鼠的肝癌[3]、肺癌[4]、淋巴瘤[5] 等均有明顯抑制作用；還能促進人類淋巴組織IL-2產生和釋放，這正是HIV感染機體關鍵免疫步驟；此外，對糖尿病患者高血糖所致腎小球細胞損傷也有一定逆轉作用[6]。人體試驗表明，DHEA生理劑量未見明顯毒副作用，但也有人對其大劑量服用帶來潛在危害擔憂，有試驗表明[7-8]，過氧化酶體增生劑有致癌性，DHEA大劑量服用可引起肝細胞過氧化酶體增生，而低劑量無明顯致過氧化酶體增生作用。因此，控制DHEA攝入量能合理有效降低其毒副作用。將DHEA做成凍干粉針注射劑，可降低給藥劑量，提高生物利用度，而MATHII- AS LEBLANC等[9]研究DHEA在食蟹猴中藥代動力學數據正好可以證實這一點。目前DHEA口服給藥居多，DHEA凍干粉針劑是一種注射給藥新劑型，本文建立簡便、準確、可行、高效HPLC分析方法，用于測定凍干粉針中DHEA含量，為其質量可控奠定基礎。

1 儀器與試藥

儀器：Waters 2795高效液相色譜儀；2996二極管陣列檢測器；Empower 數據處理系統； BP211D 型十萬分之一天平；KQ3200型超聲儀，UV-2501PC紫外分光光度儀。色譜柱Dikma， Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），甲醇和乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甘露醇、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀均為優級純（GR），吐溫80（純度99%）。DHEA對照品（含量：99.90%，軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所自制）；DHEA凍干粉針（含主藥10 mg/瓶）及空白輔料（軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所自制）。

2 凍干粉針制備

按照DHEA：甘露醇：吐溫80=（12：5：2）投料比，將處方量甘露醇和吐溫80置研缽中，少量滴加配制好PBS緩沖液（pH=6.0） ，研勻后采用少量遞加法加入已研細DHEA粉末，研磨均勻，加入PBS緩沖液，配制成每1 mL含有10 mg DHEA混懸液，再精密吸取1.0 mL置安瓿瓶中，在-40℃預凍后，抽真空并緩慢將溫度升至0℃升華干燥，保持一段時間，直至含水量達1%以下，得疏松狀固體后，封口即可。

3 溶液制備

3.1 對照品溶液制備

取DHEA對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。取對照品儲備液2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，作為對照品溶液。

3.2 供試品溶液制備

稱取供試品約14 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量乙腈超聲5 min，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品儲備液。 將供試品儲備液用0.22 ?m有機濾膜過濾， 精密吸取濾液2 mL至10mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，作為供試品溶液。

3.3 空白溶液制備

精密稱取與10 mg主藥相當空白輔料，加乙腈超聲5 min，并稀釋至刻度，搖勻，過濾后取2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，即可。

4 色譜條件與系統適用性試驗

采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：乙腈-水（55：45）；檢測波長206 nm；流速1.0 mL·min- 1；進樣量20 μL；柱溫：室溫。理論塔板數以DHEA算不低于5000。

按上述色譜條件，將對照品溶液、供試品溶液及空白輔料溶液分別進樣，DHEA凍干粉針保留時間為10.06 min，空白輔料在此處無色譜峰出現，說明輔料對DHEA檢測無影響。色譜圖見圖1。

5 方法學驗證[10]

5.1 線性與范圍

取對照品適量，配制成1.0 mg· mL- 1 對照品儲備液，分別精密吸取0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，得一系列濃度標準溶液。取20 μL進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積A對濃度C（mg· mL- 1）進行線性回歸，得回歸方程 A=1.0×107C+3.4×104，（n=6）（ r= 0.9998 ），結果表明，DHEA凍干粉針在0.01 mg· mL- 1～0.7 mg· mL- 1濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系。

5.2 檢測限、定量限

精密稱取對照品適量，加乙腈超聲溶解并稀釋成一系列濃度進樣，記錄色譜圖，在信噪比S/N=3時測得檢測限為10 ng，在信噪比S/N=10時測得定量限為51 ng。

5.3 儀器精密度試驗

取濃度為0.2 mg· mL- 1對照品溶液，連續進樣6次，每次20μL，以峰面積計算，所得RSD為1.1%，表明儀器精密度良好。

5.4 重復性試驗

取DHEA凍干粉針供10瓶，精密稱定其裝量，將傾出內容物混勻后，分別精密稱取供試品9份，配制成低、中、高三種濃度，照“4”項下色譜條件測定，按外標法以峰面積計算得平均標示量（%）為98.67%，RSD為0.42%。

5.5 穩定性考察

取供試品適量， 配制成0.1 mg· mL- 1、0.2 mg· mL- 1、0.3 mg· mL- 1 3種濃度，于配制后0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h各取20 μL進樣，照“3”項下色譜條件測定峰面積，結果24h內3種濃度峰面積RSD分別為1.87%、0.38%、1.03%，72 h 3種濃度峰面積RSD分別為1.49%、1.02%、1.50%，表明供試品溶液放置3天穩定，能夠滿足測定要求。

5.6 加樣回收測定

精密稱取供試品適量，6份，分別精密加入對照品適量，加適量乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取2.0 mL至10 mL量瓶中加乙腈配制成含DHEA約0.2 mg· mL- 1加樣溶液，搖勻，過濾后進樣20 μL，測定回收率，結果（見表1）DHEA凍干粉針平均回收率為98.91%，RSD=0.43%。說明用本法測定DHEA凍干粉針含量準確度良好。

6 討論

配制一定濃度對照品溶液，在190～800 nm范圍內進行全掃描（見圖2），可以看出本品為末端吸收，選擇206 nm作為檢測波長，既保證主藥能有相應吸光值，又盡量遠離溶劑截止波長。對于流動相，我們比較了甲醇-水系統和乙腈-水系統，均能有很好分離，但乙腈截止波長為190 nm，相對來說比甲醇干擾更小，故選用乙腈-水系統作為流動相。凍干粉針中主藥DHEA不溶于水，可溶于有機溶劑，但輔料為水溶性，采用純有機溶劑提取，這就大大減少了輔料對其干擾，由液相色譜圖也可以進一步驗證，空白輔料對測定無干擾。

凍干粉針劑相對于水針劑質量更穩定，也更適合于給藥劑量較小藥物。DHEA為類固醇激素，給藥劑量小，對多種疾病均有較好治療作用，制成凍干粉針劑，不僅可以提高生物利用度，也可以相對降低潛在毒副作用，進一步增加了藥物給藥方式選擇途徑。

參 考 文 獻

[1] T， Ishizuka； K， Kajita； A， Miura，et al. DHEA improves glucose uptake via activations of protein kinase C and phosphatidylinositol 3-kinase[J].Am J Physiol.1999，276（1，pt.l）E196-204.

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[9] MATHIAS LEBLANC，CLAUDE LABRIE，ALAIN BELANGER，et al. Bioavailability and Pharmacokinetics of Dehydroepiandrosterone in the cynomolgus monkeys[J]. The Journal of Clinical Endocrinology &Metabolism.2003，88（9）：4293-4302.

[10] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（二部）.北京： 中國醫藥科技出版社，2010： 附錄194-195.