RP—HPLC法測(cè)定凍干粉針中DHEA的含量

陳曉靜　何杰　楊建云等

[摘 要] 目的：建立反相高效液相色譜法測(cè)定凍干粉針中DHEA含量。方法：采用Diamonsil C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（55：45），流速1.0 mL · min- 1；檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm；進(jìn)樣量20 μL ；柱溫：室溫。結(jié)果：在此色譜條件下DHEA與有關(guān)物質(zhì)能達(dá)到較好分離，在0.01 mg · mL- 1～

0.7 mg · mL- 1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系， r=0.9998；方法重復(fù)性RSD為0.42%；加樣平均回收率（n=6）為98.91%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，專屬性好，可用于測(cè)定DHEA凍干粉針含量。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜；凍干粉針；DHEA；類固醇激素

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）05-071-03

[Abstract] Objective： To establish an RP-HPLC method for determination of the content of DHEA. Methods：Diamonsil C18 （250 mm× 4.6 mm，5 μm） column was adopted ； the mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile - water （55：45） at the flow rate was 1.0 mL·min- 1 ；The ultraviolet detection wavelength was set at 206 nm； Loaded volume was 20 μL； the column temperature was room temperature. Results： DHEA and its related substances could be separated well. The linearity of DHEA was well correlated （ r=0.9998） within the range of 0.01 mg · mL- 1～0.7 mg · mL- 1. The method precision RSD was 0.42%. The average recoveries （n=6） was 98.91%. Conclusion： The method appeared to be accurate， reliable， sensitive， specific and can be used for the determination of the content of freeze-dried powder injection DHEA .

[Key words] HPLC；freeze-dried powder injection；DHEA； steroid hormone

引言

DHEA（脫氫表雄酮，dehydroepiandrosterone）為腎上腺及性腺分泌的一種類固醇激素，經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，DHEA具抗衰老、預(yù)防心血管疾患、改善記憶、增強(qiáng)免疫力作用[1～2]，對(duì)小鼠的肝癌[3]、肺癌[4]、淋巴瘤[5] 等均有明顯抑制作用；還能促進(jìn)人類淋巴組織IL-2產(chǎn)生和釋放，這正是HIV感染機(jī)體關(guān)鍵免疫步驟；此外，對(duì)糖尿病患者高血糖所致腎小球細(xì)胞損傷也有一定逆轉(zhuǎn)作用[6]。人體試驗(yàn)表明，DHEA生理劑量未見(jiàn)明顯毒副作用，但也有人對(duì)其大劑量服用帶來(lái)潛在危害擔(dān)憂，有試驗(yàn)表明[7-8]，過(guò)氧化酶體增生劑有致癌性，DHEA大劑量服用可引起肝細(xì)胞過(guò)氧化酶體增生，而低劑量無(wú)明顯致過(guò)氧化酶體增生作用。因此，控制DHEA攝入量能合理有效降低其毒副作用。將DHEA做成凍干粉針注射劑，可降低給藥劑量，提高生物利用度，而MATHII- AS LEBLANC等[9]研究DHEA在食蟹猴中藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)正好可以證實(shí)這一點(diǎn)。目前DHEA口服給藥居多，DHEA凍干粉針劑是一種注射給藥新劑型，本文建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可行、高效HPLC分析方法，用于測(cè)定凍干粉針中DHEA含量，為其質(zhì)量可控奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器：Waters 2795高效液相色譜儀；2996二極管陣列檢測(cè)器；Empower 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)； BP211D 型十萬(wàn)分之一天平；KQ3200型超聲儀，UV-2501PC紫外分光光度儀。色譜柱Dikma， Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），甲醇和乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甘露醇、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀均為優(yōu)級(jí)純（GR），吐溫80（純度99%）。DHEA對(duì)照品（含量：99.90%，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所自制）；DHEA凍干粉針（含主藥10 mg/瓶）及空白輔料（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所自制）。

2 凍干粉針制備

按照DHEA：甘露醇：吐溫80=（12：5：2）投料比，將處方量甘露醇和吐溫80置研缽中，少量滴加配制好PBS緩沖液（pH=6.0） ，研勻后采用少量遞加法加入已研細(xì)DHEA粉末，研磨均勻，加入PBS緩沖液，配制成每1 mL含有10 mg DHEA混懸液，再精密吸取1.0 mL置安瓿瓶中，在-40℃預(yù)凍后，抽真空并緩慢將溫度升至0℃升華干燥，保持一段時(shí)間，直至含水量達(dá)1%以下，得疏松狀固體后，封口即可。

3 溶液制備

3.1 對(duì)照品溶液制備

取DHEA對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，作為對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液制備

稱取供試品約14 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量乙腈超聲5 min，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品儲(chǔ)備液。 將供試品儲(chǔ)備液用0.22 ?m有機(jī)濾膜過(guò)濾， 精密吸取濾液2 mL至10mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，作為供試品溶液。

3.3 空白溶液制備

精密稱取與10 mg主藥相當(dāng)空白輔料，加乙腈超聲5 min，并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾后取2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，即可。

4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-水（55：45）；檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm；流速1.0 mL·min- 1；進(jìn)樣量20 μL；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)以DHEA算不低于5000。

按上述色譜條件，將對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白輔料溶液分別進(jìn)樣，DHEA凍干粉針保留時(shí)間為10.06 min，空白輔料在此處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明輔料對(duì)DHEA檢測(cè)無(wú)影響。色譜圖見(jiàn)圖1。

5 方法學(xué)驗(yàn)證[10]

5.1 線性與范圍

取對(duì)照品適量，配制成1.0 mg· mL- 1 對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密吸取0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，得一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積A對(duì)濃度C（mg· mL- 1）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=1.0×107C+3.4×104，（n=6）（ r= 0.9998 ），結(jié)果表明，DHEA凍干粉針在0.01 mg· mL- 1～0.7 mg· mL- 1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

5.2 檢測(cè)限、定量限

精密稱取對(duì)照品適量，加乙腈超聲溶解并稀釋成一系列濃度進(jìn)樣，記錄色譜圖，在信噪比S/N=3時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為10 ng，在信噪比S/N=10時(shí)測(cè)得定量限為51 ng。

5.3 儀器精密度試驗(yàn)

取濃度為0.2 mg· mL- 1對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，以峰面積計(jì)算，所得RSD為1.1%，表明儀器精密度良好。

5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取DHEA凍干粉針供10瓶，精密稱定其裝量，將傾出內(nèi)容物混勻后，分別精密稱取供試品9份，配制成低、中、高三種濃度，照“4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得平均標(biāo)示量（%）為98.67%，RSD為0.42%。

5.5 穩(wěn)定性考察

取供試品適量， 配制成0.1 mg· mL- 1、0.2 mg· mL- 1、0.3 mg· mL- 1 3種濃度，于配制后0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h各取20 μL進(jìn)樣，照“3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果24h內(nèi)3種濃度峰面積RSD分別為1.87%、0.38%、1.03%，72 h 3種濃度峰面積RSD分別為1.49%、1.02%、1.50%，表明供試品溶液放置3天穩(wěn)定，能夠滿足測(cè)定要求。

5.6 加樣回收測(cè)定

精密稱取供試品適量，6份，分別精密加入對(duì)照品適量，加適量乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取2.0 mL至10 mL量瓶中加乙腈配制成含DHEA約0.2 mg· mL- 1加樣溶液，搖勻，過(guò)濾后進(jìn)樣20 μL，測(cè)定回收率，結(jié)果（見(jiàn)表1）DHEA凍干粉針平均回收率為98.91%，RSD=0.43%。說(shuō)明用本法測(cè)定DHEA凍干粉針含量準(zhǔn)確度良好。

6 討論

配制一定濃度對(duì)照品溶液，在190～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描（見(jiàn)圖2），可以看出本品為末端吸收，選擇206 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，既保證主藥能有相應(yīng)吸光值，又盡量遠(yuǎn)離溶劑截止波長(zhǎng)。對(duì)于流動(dòng)相，我們比較了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，均能有很好分離，但乙腈截止波長(zhǎng)為190 nm，相對(duì)來(lái)說(shuō)比甲醇干擾更小，故選用乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相。凍干粉針中主藥DHEA不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑，但輔料為水溶性，采用純有機(jī)溶劑提取，這就大大減少了輔料對(duì)其干擾，由液相色譜圖也可以進(jìn)一步驗(yàn)證，空白輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

凍干粉針劑相對(duì)于水針劑質(zhì)量更穩(wěn)定，也更適合于給藥劑量較小藥物。DHEA為類固醇激素，給藥劑量小，對(duì)多種疾病均有較好治療作用，制成凍干粉針劑，不僅可以提高生物利用度，也可以相對(duì)降低潛在毒副作用，進(jìn)一步增加了藥物給藥方式選擇途徑。

參 考 文 獻(xiàn)

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