臍帶間充質干細胞無血清和含胎牛血清培養體系比較

陳林，張坤，董偉，楊珂，艾輝，陳祿華

(重慶市干細胞企業工程研究中心，重慶 401320)

臍帶間充質干細胞無血清和含胎牛血清培養體系比較

陳林，張坤，董偉，楊珂，艾輝，陳祿華

(重慶市干細胞企業工程研究中心，重慶 401320)

為了比較在無血清與含胎牛血清培養基中人臍帶間充質干細胞的增殖能力、生物學特性、分化潛能，將臍帶華通氏膠剝出剪碎，分別在無血清與含胎牛血清培養基中培養擴增臍帶間充質干細胞。用MTT法檢測細胞增殖活性，并繪制生長曲線;在倒置顯微鏡下對細胞形態進行觀察;利用流式細胞儀檢測鑒定其表面標記CD73，CD90，CD105，CD14，CD34，CD45，CD79a及HLA－DR的表達;將成骨及成脂誘導液培養1～2周后觀察其細胞形態學變化，用堿性磷酸酶染色鑒定其成骨情況，油紅O染色鑒定其成脂情況。結果表明:無血清與含胎牛血清培養基所培養的人臍帶間充質干細胞在細胞形態、增殖活性、表面標記和分化潛能相似;但在無血清培養基成分中無動物源蛋白引入，是更理想的人臍帶間充質干細胞培養基種類。

間充質干細胞;細胞培養;無血清培養基;胎牛血清

臍帶中間充質干細胞含量遠高于骨髓和臍血，且具更強更穩定的增殖分化能力［1］，且臍帶取材方便，來源充足，對供者無傷害，病原微生物感染率小，是一種最好的間充質干細胞來源。臍帶中間充質干細胞來源于中胚層，具有自我復制、多向分化和免疫調控能力，且能定向分化為成骨細胞脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞等［2］，是各種多功能干細胞中治療血液疾病和再生醫學惟一安全的異體干細胞［3］。目前，常規的MSCs培養體系中均加入了一定比例的動物血清成分。血清是由不同分子組成的復雜混合物，給細胞培養的標準化、細胞表達產品的分離純化帶來了很大的困難，同時動物血清內的特異蛋白是已被確定的過敏原，可能對將來臨床應用構成威脅［4］。無血清培養在很大程度上避免了含血清培養的缺陷。本研究通過比較無血清培養體系和含血清培養體系培養的人臍帶間充質干細胞，探尋了一種無血清培養人間充質干細胞的方法，以達到臨床治療的應用標準。

1 試驗材料和方法

1.1 實驗材料

主要試劑:DMEM/F12培養基、TrypLE 1X、脂肪細胞和成骨細胞誘導培養基均購自Gibco公司;胎牛血清FBS購自Stemcell公司;無血清培養基購自Lonza公司;CD14－FITC，CD34－PE，CD45－FITC，CD79a－PE，HLA－DR FITC購自Beckman Coulter公司;CD73－FITC，CD90－FITC，CD105－PE購自eBioscience公司;MTT、DMSO和油紅O購自Sigma公司;堿性磷酸酶試劑盒購自碧云天公司。

主要設備:二氧化碳培養箱采購自Thermo Fisher公司;Bio－Rad 680酶標儀購自Bio－Rad公司;EpicsXL ADC流式細胞儀購自Bcekman Coulter公司;IX51顯微鏡采購自奧林巴斯公司。

所有的臍帶標本均來自足月自然分娩或剖宮產的健康產婦，并征得家屬及產婦同意。臍帶采集之前已對產婦進行了艾滋病病毒抗體檢查、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒核心抗體、梅毒螺旋體抗體、丙型肝炎病毒抗體，全部檢查結果為陰性，合格。

1.2 實驗方法

1.2.1 人臍帶間充質干細胞的分離、培養及擴增

在生物安全柜中取出采回的胎兒臍帶，置于培養皿中。將其剪成小段，用無菌PBS充分洗滌除去殘留血液，用鑷子小心除去血管和外膜，分離得到純凈的華通氏膠組織，將其剪碎成1～2 mm3的小塊，將0.5 g組織分別置于無血清培養基及含10%胎牛血清培養基中，并移至T75培養瓶中，置37℃、5%CO2體積濃度的飽和濕度的二氧化碳培養箱內培養。

每日定期觀察，第5天和第10天全量換液，以后每3天全量換液1次。待培養瓶內細胞已生長至80%融合，用TrypLE于室溫下消化并輕輕拍打，鏡下觀察培養瓶內細胞已完全成為懸液，終止消化過程，以1×104/cm2細胞濃度傳代擴增。

1.2.2 細胞生長活性測定

稱取250 mg MTT，加50 mL滅菌PBS溶液使MTT充分溶解，再用0.22μm的醋酸纖維濾器除菌，4℃避光保存備用。

取以無血清培養基培養和含血清培養基培養的狀態良好的P0代細胞，分別加入無血清培養基和含血清培養基吹打混勻制成濃度為5×104/mL的細胞懸液。

取7塊96孔板，在外周孔加入滅菌PBS填充，第二豎排孔加入無血清培養基作為空白對照，其余每孔接種100μL無血清培養基制成的細胞懸液，并加入200μL無血清培養基填充，每3天對96孔板內培養基進行換液。再取7塊96孔板進行以上操作，但將培養基換為含血清培養基，細胞懸液換為用含血清培養基制備的細胞懸液。

將96孔板置于二氧化碳培養箱內培養。培養開始后每24 h分別取出2塊96孔板，在酶標儀OD492nm處測量各孔的吸光值。

計算各孔波長吸光度值和空白96孔板吸光度值的差值即A值，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制生長曲線。

1.2.3 細胞表面標志的鑒定

分別取用含血清和不含血清培養基培養的P2代臍帶間充質干細胞，用TrypLE消化后制成單細胞懸液，細胞濃度為2×106/mL。取100μL細胞懸液，分別加入抗體10μL于20℃避光孵育20 min。抗體分別為小鼠抗人CD14－FITC，CD34－PE，CD45－FITC，CD79a－PE，HLA－DR－FITC，CD73－FITC，CD90－FITC，CD105－PE。孵育結束后，洗滌細胞2遍，加入300μL流式鞘液中，待流式細胞儀檢測。

1.2.4 MSCs誘導分化

1)脂肪細胞誘導分化

收集P2代對數生長期的臍帶間充質干細胞，以1×104/cm2密度接種于24孔板中，待細胞達到60%融合時，去掉原培養基，PBS洗滌1次，更換為脂肪細胞誘導培養基，每3～4天換液1次，培養7～14天。觀察到脂滴形成時，吸去誘導培養液，PBS洗滌2次，體積分數為4%的多聚甲醛固定15 min，以質量分數為0.5%油紅O染色20 min，水洗數次，在顯微鏡下觀察、拍照。

2)成骨細胞誘導分化

收集P2代對數生長期的臍帶間充質干細胞，以1×104/cm2密度接種于24孔板中，待細胞達到60%融合時，去掉原培養基，PBS洗滌1次，更換為成骨細胞誘導培養基，每3～4天換液1次。培養14天后，吸去誘導培養液，PBS洗滌2次，無水乙醇固定10 min，水洗數次，加入堿性磷酸酶染色劑，孵育8～12 h，水洗數次，在顯微鏡下觀察、拍照。

2 實驗結果

2.1 細胞形態學觀察

無血清組在培養第10天可見少量細胞遷出，細胞呈紡錘形、長梭形、多角形、逗號等形態。原代培養第12天細胞融合達到約70%(見圖1)，大部分細胞呈紡錘形和長梭型，少量細胞呈多角形。傳代后細胞生長速度加快、純度提高，以平行排列生長為主或呈漩渦狀生長(見圖2)。約2～3天后可再傳代。

圖1 無血清培養原代第12天(40×)

圖2 含血清培養原代第12天(40×)

血清組在培養第10天可見部分細胞遷出，細胞形態與無血清組無異，細胞生長度速度較無血清組稍快。原代培養第12天細胞融合達到約80%(見圖2)，細胞形態與無血清組無異。傳代后細胞生長速度和細胞純度均有明顯提高，亦呈平行排列生長或漩渦狀生長(見圖3)。約2～3天后可再傳代。

圖3 無血清培養P2代第2天(40×)

圖4 含血清培養P2代第2天(40×)

2.2 細胞生長活性測定

橫軸為培養時間(以每天計)，縱軸為OD值繪制生長曲線。細胞接種1～2天為緩慢生長的潛伏期，從第3天即進入對數生長期，兩種培養基培養的細胞都從第5天進入平臺期，細胞倍增時間為30 h，P＞0.05，兩種培養基培養的細胞增殖曲線無顯著差異(見圖5)。

圖5 兩種培養基培養的細胞增殖曲線

2.3 細胞表面標志分析

流式細胞術分析表明，無血清培養基和含血清培養基培養的臍帶MSCs均高表達粘附分子和基質細胞標記CD73，CD90，CD105，不表達造血細胞標記CD14，CD34，CD45，CD79a(圖6)，不表達主要組織相容性復合物類分子HLA－DR。

圖6 兩種培養基培養的細胞表面標志比較

2.4 體外誘導分化

2.4.1 脂肪細胞誘導分化

經成脂誘導2周后，P2代人臍帶MSCs可以分化為脂肪細胞。進行油紅O染色，可見胞漿中有大量被染成紅色的脂滴(見圖7)。

2.4.2 成骨細胞誘導分化

經成骨誘導2周后，P2代人臍帶MSCs可以分化為成骨細胞。進行堿性磷酸酶染色，可以看見大量紫色沉淀(見圖8)。

圖7 人臍帶MSC油紅O染色結果(400×)

圖8 人臍帶MSC堿性磷酸酶染色結果(40×)

3 討論與結論

間充質干細胞具有自我更新能力和多向分化能力［5］，同時還具有雙向免疫調節的功能［6］。目前分離人臍帶間充質干細胞，主要來源于自臍帶的wharton’s jelly及臍靜脈皮下層［7－8］，其主要分離方法是酶消化法和組織塊法。本實驗采用組織塊法由貼壁的組織直接獲得MSC，相對酶消化法的化學反應過程而言對細胞傷害較小［9］。

獲得安全可靠、質量穩定的間充質干細胞是臨床應用的前提，常規的血清培養體系由于血清的特性，異種血清的使用存在著很多不確定因素［10］，比如，血清批次之間的差別、異種蛋白的免疫原性、潛在的病原體等。異種血清的種種潛在危害，使其生物安全性受到普遍質疑［11］。由于動物血清應用的缺陷，有些研究人員采用人血清來代替胎牛血清，促進細胞增殖并且保持間充質干細胞的分化潛能，隨著細胞擴增以及干細胞臨床應用量的增大，人血清來源成為難以解決的問題［12］。無血清培養避免了含血清培養帶來的難題，成為當今細胞培養領域的一大趨勢。

無血清培養和含血清培養都成功獲得了大量臍帶MSC，兩種培養基所培養細胞在形態方面類似，含血清培養的細胞體積略小，增殖速度略快于無血清培養。細胞免疫表型的分析表明，兩種培養基所培養細胞的免疫分子表達類似，CD73，CD90，CD105≥95%;CD14，CD34，CD45，CD79a，HLA－DR≤2%，符合ISCT組織對間充質干細胞的定義要求［13］。在誘導培養條件下，兩種培養基所培養細胞均有相似的成骨和脂肪分化能力，具有較強的可塑性與多向分化潛能。

總之，本研究利用無血清培養基成功分離培養出臍帶MSC，和含血清培養基培養出的細胞具有相似的生物學特性，完全可以替代含血清培養基。隨著國家《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》等文件出臺，對于培養基成分提出了嚴格要求，可以預見未來無血清培養將在臨床干細胞培養領域占據主導地位，具有廣闊的應用前景。

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(責任編輯 何杰玲)

Com parison of the Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Cultured by Serum-free Medium and Fetal Bovine Serum-contained Medium

CHEN Lin，ZHANG Kun，DONGWei，YANG Ke，AIHui，CHEN Lu－hua
(Chongqing Enterprise Engineering Research Center of Stem Cell，Chongqing 401320，China)

To compare the differences of proliferation，biological characteristics，differentiation potential of serum－free and fetal bovine serum－contained medium cultured human umbilical cord－derived mesenchymal stem cells.Separated Wharton’s jelly from human umbilical cord，cultured umbilical cord mesenchymal stem cells in serum－freemedium and serum－supplied medium.Detected the cells’proliferation rate by MTTmethod and get the cell growth curve;observe the cellmorphology by microscope;Use flow cytometer to identify surface markers CD73，CD90，CD105，CD14，CD34，CD45，CD79a，and HLA－DR.We observe cells change of shape after cells cultured by Osteogenesis Differentiation and Adiposeness Differentiation medium.Use alkaline phosphatase and oil red O stai－ningmethods to ensure cells’differentiation.The cell morphology，proliferation activity，surface markers and differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in serum－freemedium are similarwith which cultured in FBS－suppliedmedium.The composition of the serum－freemedium are animal origin free and the composition are known，so it’s a better human umbilical cord mesenchymal stem cell culturemediamedium

mesenchymal stem cells;cell culture;serum－freemedium;Fetal bovine serum

Q2－33

A

1674－8425(2014)09－0057－05

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.09.013

2014－03－16

陳林，男，四川德陽人，主要從事生物技術方面的研究。

陳林，張坤，董偉，等.臍帶間充質干細胞無血清和含胎牛血清培養體系比較［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2014(9):57－61.

format:CHEN Lin，ZHANG Kun，DONGWei，et al.Comparison of the Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Cultured by Serum－free Medium and Fetal Bovine Serum－contained Medium［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(9):57－61.