含氮姜黃素類似物的合成及其酪氨酸酶抑制效應

韋星船，霍夢月，鄭成，段彥飛，楊前程，蔡偉平

（廣州大學化學化工學院，廣東 廣州 510006）

含氮姜黃素類似物的合成及其酪氨酸酶抑制效應

韋星船，霍夢月，鄭成，段彥飛，楊前程，蔡偉平

（廣州大學化學化工學院，廣東 廣州 510006）

通過芳香醛與4-乙酰基吡啶在酸堿條件下催化縮合，合成了4個單羰基姜黃素類似物A1～A4，并研究了其對酪氨酸酶的抑制活性。結果表明，3-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-吡啶基)-2-烯-1-酮對酪氨酸酶具有強抑制活性，半數抑制濃度（IC50）為45.1μmol/L，是姜黃素（IC50= 97.1μmol/L）的抑制活性的2.2倍。抑制動力學研究表明，3-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-吡啶基)-2-烯-1-酮對酪氨酸酶的抑制作用類型屬于競爭性抑制。

姜黃素類似物；合成；酪氨酸酶抑制活性；抑制動力學

酪氨酸酶是多酚氧化酶的一種，同時也是結構相當復雜的含有多亞基與銅的氧化還原酶，在各種薯類、菇類以及人體等動植物中廣泛存在，少量的微生物中也含有酪氨酸酶，又稱多酚氧化酶、酚氧化酶、兒茶酚氧化酶[1]。最早發現的酪氨酸酶具有兩種基本功能：作為單酚酶羥基化單酚生成鄰二酚；鄰二酚又被雙酚酶氧化成醌[2]。由于酪氨酸酶的這種雙重催化作用控制著黑色素的合成[3]，酪氨酸酶與果蔬的氧化褐變，昆蟲發育及傷口愈合，人的衰老有著密切的關系[4]，抑制其活性可抑制黑色素的生成。因此，酪氨酸酶抑制劑可用于化妝品中作為增白劑，也可以治療過量的黑色素沉著引起的皮膚病，黃褐斑、老年斑等；酪氨酸酶抑制劑也被用作食品保鮮劑、新型生物殺蟲劑、天然染發劑[5-9]。鑒于酪氨酸酶抑制劑在食品、醫療、農業等行業的廣泛應用，尋找性能優異的酪氨酸酶抑制劑，研究其抑制機理、抑制動力學以及其應用成為國內外學者的研究熱點。

姜黃素屬于植物多酚，主要是從姜黃、天南星科中的部分植物（如菖蒲）的根莖中提取出來，是姜黃發揮藥理作用最重要的活性成分；姜黃素是具有對稱酮的二酮類化合物，是植物界中一種非常罕見的色素，是由雙(羥基、甲氧基苯基、烯烴、酮基)構成的對稱酮，其主鏈為不飽和脂肪族及含羥基芳香族基團，結構式如圖1，為橙黃色結晶性粉末，熔點為183℃。研究表明，姜黃素是一種新型的酪氨酸酶抑制劑，同時具有抗炎、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[10-15]。此外，對黑素瘤細胞同樣有一定的抑制作用[16-17]。但由于姜黃素結構不穩定，水溶性差，血藥濃度低，在人體內容易被分解，導致其生物活性利用率極低，且姜黃素本身對酪氨酸酶的抑制活性不高，這些嚴重妨礙了姜黃素在醫療方面作為酪氨酸酶抑制劑的進一步研究應用。一些科學家為增加其水溶性而制備出納米姜黃素顆粒[18]，同時為了發現有價值的化合物，國內外科學家們對其結構進行了改造，發現了一系列酪氨酸酶抑制活性較高的姜黃素類似物。如2,5-雙(2,4-二羥基苯亞甲基)環戊酮（結構如圖2）[19]。

圖1 姜黃素結構

圖2 2,5-雙(2,4-二羥基苯亞甲基)環戊酮結構

本文作者設計合成了4個單羰基姜黃素類似物A1、A2、A3、A4，研究了其對酪氨酸酶的抑制活性和抑制動力學類型。經SciFinder 數據庫檢測，其中A4為未見報道的新化合物。

4個姜黃素類似物的合成路線如式（1）。

1 實驗材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

4-乙酰基吡啶，分析純，上海aladdin有限公司；取代苯甲醛，分析純，美國AcrosOrganics公司；L-多巴，分析純，Worthington Biochem公司；酪氨酸酶，比活力為3933 U/mg，Worthington Biochem公司；其他試劑均為分析純。

硅膠薄層色譜板（TLC），青島海洋化工廠；雙目鏡X-5型顯微熔點測定儀，北京泰京儀器有限公司；電子分析天平，上海第二天平儀器廠；AVANCE-DPX300型核磁共振儀：1H NMR譜300MHz，瑞士Bruker公司；PHS-25數顯pH計，上海精密科學儀器有限公司；ESQUIRE 3000型質譜分析儀，德國Bruker光譜儀器公司；UV-1102PC型紫外分光光度儀，日本島津制作所；SDZF-6021型真空干燥箱，河南天馳儀器設備有限公司。

1.2 含氮姜黃素類似物的合成

含不同取代基的芳香醛與4-乙酰基吡啶在酸性或堿性條件下催化反應，合成4種化合物A1～A4[20-24]。A1，1-(4-吡啶基)-3-(4-甲氧基苯基)-2-烯-1-酮；A2，1-(4-吡啶基)-3(3,4,5-三甲氧基苯基)-2-烯-1-酮；A3，3-(4-二甲胺基苯基)-1-(4-吡啶基)-2-烯-1-酮；A4，3-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-吡啶基)-2- 烯-1-酮。

1.2.1 化合物A1～A4的合成

分別稱取0.01mol的取代苯甲醛、0.005mol的4-乙酰基吡啶，置于50mL圓底燒瓶中，四氫呋喃作為反應溶劑，常溫常壓下，緩慢滴加催化劑，攪拌30min，溶液由淡黃色轉變為深黃色，靜置3天，溶液呈現比之前更深的黃色。過硅膠柱分離提純，旋轉蒸發，加入三氯甲烷重結晶得目標產物A1～A4，其中A1～A3以2mL 40%的氫氧化鈉水溶液作為催化劑，A4以2mL嗎啉作為催化劑。

1.3 含氮姜黃素類似物對酪氨酸酶抑制活性、抑制率測試

酪氨酸酶抑制活性測定是采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測，在Matsuda等[25-28]報道的酶學測定方法基礎上稍加改進進行。以0.5mmol/L L-DOPA為底物；分別取適當量的樣品（溶于DMSO中），960 μL底物，24 μL酶，用緩沖液將體系補充到4000 μL得測活體系，以不加酶只加抑制劑和底物為空白，室溫下測定反應1min內測活體系在波長475 nm紫外光照射下吸光度隨時間的變化曲線，得斜率qi。并將斜率qi與不加抑制劑時用相同方法測得的q0相比得一百分數，即為酪氨酸酶剩余酶活力。然后以樣品在混合溶液中終濃度為橫坐標，剩余酶活力為縱坐標作圖，圖中酶活力下降50%時抑制劑的濃度即為半數抑制濃度IC50，IC50值越小，抑制作用越強。測活體系中酪氨酸酶的終濃度為37.2mg/L，DMSO的終體積分數≤2%。

1.4 含氮姜黃素類似物對酪氨酸酶抑制動力學測試

固定酪氨酸酶為24μL，抑制劑的濃度分別為0、26μmol/L、53μmol/L、80μmol/L時，改變底物L-DOPA的濃度，在含底物、酪氨酸酶、抑制劑、0.05mol/L磷酸緩沖液（pH = 6.8）的測活體系中，用上述方法測定不同濃度含氮姜黃素類似物對酪氨酸酶活力的影響，采用Lineweaver-Burk雙倒曲線判定抑制類型。

2 實驗結果與討論

2.1 含氮姜黃素類似物的結構表征

A1：產率71.4%，熔點120～121℃。1H NMR（DMSO-d6，300MHz），δ：8.75 （d，J=4.8 Hz，2H）7.69（d，J=4.5 Hz，2H），7.54（t，1H），7.23（d，J=15.6 Hz，2H），6.88 （d，J=0.6 Hz，2H），6.86（s，1H），3.78（d，J=1.5 Hz，3H）；13C NMR （CDCl3，75MHz），δ（ppm） 189.77，162.24，150.64，146.78，144.83，130.64，121.57，114.57，55.48； IR（cm-1）:3068，2977，1737， 1598，804，1664.

A2:產率53.1%，熔點96～97℃。1H NMR（DMSO-d6，300MHz） δ：8.78（d，J=3.9，2H），7.71（t，2H），7.52 （t，3H），7.23（t，3H），6.87（d，J=0.6 Hz，2H），3.78（t，9H）.13C NMR（CDCl3，75MHz），δ:188.16，150.72，146.75，143.19，141.02，133.13，130.65，121.56， 118.77，111.15，55.49. IR（cm-1）：3031，2939，1672，1608，465，840.

A3:產率63.2%，熔點125～126℃。1H NMR（DMSO-d6，300MHz） δ：8.69（m，2H），7.65（m，2H） 7.44（m，1H），7.13 （t，2H），7.08（t，1H），6.56（m ，2H），2.94（t，6H） .13C NMR（CDCl3，75MHz），δ：189.52，152.43，150.50，147.87，145.48，130.92，121.91，121.56，115.62，111.76，40. 07. IR（cm-1）：3068，2977，1737，1664，1598，842.

A4：產率56.4%，熔點 116～117℃。1H NMR（DMSO-d6，300MHz）. δ：8.91（t，2H），7.95（s，2H），7.55（t，1H），6.71（m，1H），6.21（t，2H），5.01（s，1H），3.86（t，6H）.13C NMR（CDCl3，75MHz），δ:191.93，152.21，150.52，143.15，141.07，130.53，128.01，122.89，120.54，106.53，56.426. IR（cm-1）： 3234，3045，2908，1712，1546，1446.

2.2 含氮姜黃素類似物對酪氨酸酶抑制活性

以L-DOPA為底物，檢測化合物對酪氨酸酶的抑制活性，測試結果見圖3及表1。圖3中的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分別為姜黃素、合成物A1、A2、 A3、A4對酪氨酸酶的抑制作用曲線圖。表1中抑制率是在抑制劑濃度為100μmol/L時測得。

由表1可知，4個含氮姜黃素類似物對酪氨酸酶都有一定的抑制作用，抑制活性強弱順序為A4＞A2＞A3＞A1＞姜黃素，其抑制作用均比姜黃素的抑制作用強。其中化合物3-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-吡啶基)-2-烯-1-酮（A4）的抑制活性最強，是姜黃素的2.2倍。A4的苯環連接—OH，可見，芳香環上的—OH能增強姜黃素類似物對酪氨酸酶的抑制活性，但并不是唯一活性基團；姜黃素的對稱結構及碳鏈上的活潑亞甲基不是維持其酪氨酸酶抑制活性的唯一有效基團；同時姜黃素中的苯環被吡啶環取代，引入N雜原子，使基團的吸電子能力增強，從而增強化合物的酪氨酸酶抑制活性；在4-位甲氧基的鄰位引入兩個甲氧基形成含有3個甲氧基的基團，能使化合物的活性增強，但同時化合物的毒性增強，不利于其進入臨床應用，需要進一步的研究，使毒性降低。

圖3 化合物對酪氨酸酶的抑制作用曲線

表1 含氮姜黃素類似物對酪氨酸酶的抑制活性

2.3 含氮姜黃素類似物對酪氨酸酶的抑制動力學

姜黃素類似物A4對酪氨酸酶催化氧化L-DOPA抑制作用的Lineweaver-Burk曲線如圖4所示，圖中橫坐標為底物L-DOPA濃度的倒數，縱坐標為反應速度的倒數值（1min內吸光度隨時間變化值的倒數）。圖4的曲線1、2、3、4分別是抑制劑濃度為0、26μmol/L、53μmol/L、80μmol/L時的測試結果。

圖4 合成物A4抑制酪氨酸酶催化氧化L-DOPA的Lineweaver-Burk曲線

由圖4可知，抑制劑3-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-吡啶基)-2-烯-1-酮的Lineweaver-Burk雙倒數圖為交于縱軸一點的一組直線，各直線橫軸截距隨化合物濃度的變化而改變，其抑制類型屬于競爭性抑制。該化合物主要通過與酪氨酸酶中的雙銅離子作用導致其活性減弱[31]。該抑制劑I（A4）的化學結構與酶作用的底物S(L-DOPA)十分類似，它們都能與酪氨酸酶的活性中心結合，兩者對酶的結合有競爭作用；結合后分別形成EI或ES復合物。形成EI后酶不具催化作用，由此導致反應系統中游離酶濃度降低并使酶活性抑制。此時只要增加底物濃度就增加了底物與酶形成ES的可能性。因此反應系統中加入的底物濃度足夠高，就有可能使全部EI解離為E和I，E和底物形成ES，從而恢復酶的全部活性。

3 結 論

酪氨酸酶抑制劑廣泛應用于醫藥、化妝品、食品保鮮等行業，其來源只要有以下三方面：①從天然植物組織分離提取；②從商品化合物中篩選；③有機合成出新的化合物。當今社會以綠色環保為發展宗旨，合成活性良好、安全無毒的活性物質是國內外學者的研究熱點，用簡便易行的方法合成單羰基姜黃素類似物，測試其抑制酪氨酸酶活性，并探討其作用機理。結果顯示，本文合成的含氮單羰基姜黃素類似物比姜黃素具有更強的抑制活性，芳香環上的—OH能增強合成物對酪氨酸酶的抑制活性。因此，進行深入研究，建立構效關系模型，有針對性的合成更多對酪氨酸酶有強抑制活性的姜黃素類似物，開發可應用于醫藥、化妝品、食品保鮮、殺蟲劑等行業的酪氨酸酶抑制劑，具有廣泛的應用價值。

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Synthesis and tyrosinase inhibitory effect of curcumin analogues containing nitrogen

WEI Xingchuan，HUO Mengyue，ZHENG Cheng，DUAN Yanfei，YANG Qiancheng，CAI Weiping
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 51006，Guangdong，China）

Four pyridyl asymmetrical curcumin analogues were synthesized by 4-acetyl pyridine and appropriate aromatic aldehyde with alkaline and acid catalytic condensation respectively. Their inhibition activity on tyrosinase was evaluated. The results indicate that 3-(4-hydroxyl-3,5-dimethoxyphenyl)-1-(4-pyridyl)-2-en-propanone has the strongest inhibition on tyrosinase，semi inhibitor concentration is 45.1 μmol/L which is 2.2 times of curcumin （IC50= 97.1 μmol/L）. Study on inhibitive kinetics discovers that the inhibition on tyrosinase belong to competitive model.

curcumin analogues；synthesis；tyrosinase inhibitory activity；kinetic study

TQ 463

A

1000-6613（2014）08-2155-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.08.036

2014-03-05；修改稿日期：2014-04-13。

廣東省科技計劃項目（2011B050400028）。

及聯系人：韋星船（1964—），女，教授，博士，碩士生導師。E-mail xing6363@126.com。