自噬抑制劑對乙醇誘導的肝星狀細胞活化作用的影響

何月賈寶輝劉曼羅文張吉翔△

自噬抑制劑對乙醇誘導的肝星狀細胞活化作用的影響

何月1賈寶輝1劉曼2羅文2張吉翔2△

目的觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）對乙醇誘導的肝星狀細胞（HSC）活化作用，并探討其作用機制。方法體外培養大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，設立空白對照組、陽性對照組（乙醇刺激組）、低劑量組（5 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）、高劑量組（10 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）。RT-PCR分析各組HSC活化標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及Ⅰ型膠原基因表達，Western blot法檢測各組HSC中自噬水平標志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA、Ⅰ型膠原表達；MTT法檢測3-MA對乙醇誘導的HSC增殖的影響。結果與空白對照組比較，陽性對照組中α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達及LC3Ⅱ表達量明顯增加（P＜0.05），高劑量組卻顯著減少（P＜0.01）；與陽性對照組比較，低劑量組和高劑量組中α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達及LC3Ⅱ表達量逐漸減少（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組中α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達及LC3Ⅱ表達減少（P＜0.05）。與陽性對照組比較，加入3-MA處理后的HSC增殖顯著減少（P＜0.05）。結論3-MA可抑制乙醇誘導的HSC-T6細胞中LC3Ⅱ蛋白的表達、α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA及蛋白的表達，抑制HSC增殖，且高劑量的作用更明顯。

自噬；乙醇；肝硬化，酒精性；3-甲基腺嘌呤；肌動蛋白類；膠原Ⅰ型；肝星狀細胞

酒精性肝纖維化（alcoholic liver fibrosis，ALF）是長期過量飲酒導致的一種慢性肝臟疾病，最初表現為酒精性脂肪肝，進而發展為酒精性肝炎、肝纖維化乃至肝硬化[1]。ALF是肝癌死亡的主要原因之一，是多基因、多階段、多途徑的復雜過程，然而至今仍缺乏早期、有效的治療措施，故探討ALF的發病機制及治療靶點尤為重要。自噬（autophagy）是指從粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體（autophagosome），并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，在細胞生長發育、蛋白質代謝平衡及細胞內環境穩態的維持等過程中發揮著重要的調控作用[2]。在肝纖維化發生過程中，各種致病因素刺激下HSC活化，細胞內儲存的脂滴消失后，表型向肌纖維母細胞轉化，表達其活化標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)并大量分泌以I型膠原蛋白為主要成分的細胞外基質并最終導致肝內基質沉積。目前關于自噬的研究多集中于炎癥、腫瘤、神經退行性疾病等領域[3]，而自噬在乙醇誘導的肝星狀細胞活化進而發生肝纖維化中的作用研究甚少。本實驗使用不同劑量的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）作用于乙醇刺激后的肝星狀細胞（HSC），觀察其HSC活化水平，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購自湘雅細胞庫，3-MA購自Sigma公司，培養基DMEM購自HyClone公司。胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Solarbio公司。TRIzol、DMSO購自北京全式金生物技術公司。逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。引物由上海生工生物工程公司合成。2×PCR MasterMix購自北京全式金生物技術公司。總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。兔抗LC3多克隆抗體、兔抗SMA多克隆抗體、兔抗COL1A2多克隆抗體、小鼠抗β-肌動蛋白（actin）單克隆抗體(mAb)購自Proteintech公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 3-MA儲存液的配制3-MA粉末按100 mmol/L溶解在1×無菌PBS溶液中，-20℃避光保存。使用時用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養液稀釋至所需濃度。

1.2.2HSC-T6培養HSC-T6復蘇后置于含10％胎牛血清、雙抗（100 U/mL的青霉素和100 mg/L的鏈霉素）的高糖DMEM培養基的培養瓶中，37℃、飽和空氣濕度和5％的CO2孵箱內培養。設定4個不同處理組，分別為空白對照組、陽性對照組（乙醇刺激組）、低劑量組（5 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）、高劑量組（10 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）。

1.2.3RT-PCR檢測3-MA對乙醇誘導后的HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達的影響采用Trizol提取RNA，合成cDNA后PCR擴增目的基因，同一樣本以β-actin為內參。根據GenBank上公布的大鼠的α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA序列，應用Primer Primier 5軟件設計引物。引物序列：α-SMA引物上游5′-GAAGCTGCTCCAGCTATGTGT-3′，下游5′-CAACCATCACTCCCTGG-3′，126 bp；Ⅰ型膠原引物上游5′-GATGGACTCAACGGTCTCCC-3′，下游5′-CGGCCACCATCTTGAGACTT-3′，185 bp；β-actin引物上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′，221 bp。α-SMA和β-actin的反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性35 s，退火35 s（α-SMA、β-actin為60℃，Ⅰ型膠原蛋白為62℃），72℃延伸35 s，35個循環；最后72℃7 min。取5 μL PCR產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用暗箱式紫外透射儀觀察電泳結果并拍照。結果用BANDLEAD 3.00軟件，以目的條帶/β-actin的光密度（OD）值進行分析。實驗均重復3次。

1.2.4Western blot法檢測3-MA對乙醇誘導后的HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、LC-3Ⅱ蛋白表達的影響采用蛋白抽提液分別提取各組細胞的總蛋白，全自動生化分析儀（Beckman，USA）測定蛋白濃度。取20～40 μg細胞總蛋白經5×上樣緩沖液和30 g/L SDS配平蛋白至同體積后進行100 g/L SDS-PAGE，轉移至PVDF膜上。以50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜，分別與兔抗LC3多克隆抗體(1∶800)、兔抗SMA多克隆抗體(1∶800)、兔抗COL1A2多克隆抗體(1∶800)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1 000)孵育過夜，洗滌后分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗，加入底物化學發光試劑后X線片曝光，曝光顯影的目的條帶用Quatity one 4.62軟件進行半定量分析，以內參為參考標準計算出目的條帶標準化后的OD值，以此判斷蛋白相對表達量。每次檢查均采用不同樣本重復3次。

1.2.5MTT法檢測HSC增殖水平收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入200 U，鋪板使細胞密度為1×104/孔濃度接種于96孔板中，空白調零孔只加不含細胞的培養基。實驗處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，避光振蕩15 min，酶標儀測定492 nm處各孔OD值，計算各組的平均值。每組6復孔，計算各組的平均值。

1.3 統計學方法應用SPSS 13.0進行統計分析，數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3-MA抑制乙醇誘導的HSC中α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA表達與空白對照組比較，陽性對照組中α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA表達明顯增加，高劑量組表達明顯減少；與陽性對照組比較，低劑量組、高劑量組表達減少；與低劑量組比較，高劑量組表達明顯減少，見表1。

2.2 3-MA抑制乙醇誘導的HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3Ⅱ蛋白表達與空白對照組比較，陽性對照組中α-SMA、Ⅰ型膠原、LC3Ⅱ的蛋白表達明顯增加，高劑量組表達明顯減少；與陽性對照組比較，低劑量組、高劑量組表達減少；與低劑量組比較，高劑量組表達明顯減少，見表2、圖1。

2.3 細胞增殖活力的變化與空白對照組比較，陽性對照組中細胞增殖活力明顯增加，高劑量組明顯減少；與陽性對照組比較，低劑量組、高劑量組減少；與低劑量組組比較，高劑量組明顯減少，見表2。

Tab.1 Comparison of differential expressions of α-SMA mRNA and typeⅠcollagen mRNA in HSC between four groups表1 各組HSC中α-SMA,Ⅰ型膠原的mRNA表達量的比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of differential expressions of α-SMA mRNA and typeⅠcollagen mRNA in HSC between four groups表1 各組HSC中α-SMA,Ⅰ型膠原的mRNA表達量的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，P＜0.05；表2同

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Tab.2 Comparison of differential expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3 proteins,and OD value in HSC between four groups表2 各組HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3的蛋白表達量及OD值的比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of differential expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3 proteins,and OD value in HSC between four groups表2 各組HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3的蛋白表達量及OD值的比較（n=3，±s）

組別空白對照組（1）陽性對照組（2）低劑量組（3）高劑量組（4）F α-SMA 1.507 1±0.298 2 2.339 7±0.177 2a1.612 3±0.200 3b0.687 2±0.218 8abc89.71＊Ⅰ型膠原0.184 1±0.144 5 0.675 5±0.243 5a0.153 5±0.298 1b0.090 5±0.251 9abc93.93＊組別空白對照組（1）陽性對照組（2）低劑量組（3）高劑量組（4）F LC3Ⅱ1.107 6±0.173 3 1.702 7±0.234 1a0.896 1±0.107 6b0.521 6±0.274 8abc79.07＊細胞增殖活力（OD）0.62±0.08 2.24±0.12a1.42±0.36b0.25±0.09abc103.76＊

Fig.1 The expression of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3Ⅱat the protein level圖1 α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3Ⅱ蛋白的表達

3 討論

肝纖維化是酒精性肝病發病過程中的轉折點，如能及時去除導致肝纖維化的不利因素則有可能中止肝纖維化的進程，甚至使病變向良性方面轉歸。一旦發展成肝硬化，病變則不可逆轉[4]。酒精性肝纖維化是多因素疾病，在肝纖維化發展過程中，乙醇代謝相關的氧化應激，谷胱甘肽耗竭，蛋氨酸代謝異常，營養不良，Kupffer細胞激活所致的大量炎性細胞因子釋放，肝星狀細胞激活，免疫反應及遺傳多態性等諸多因素均起到重要作用[5]。研究認為，HSC的增殖和激活是各類慢性肝病包括酒精性肝病發生肝纖維化的中心環節[6]。

當細胞處于缺氧、能量代謝異常時，常常通過自噬提高其自噬水平來維持細胞內能量代謝供給[7]。Thoen等[8]研究發現，HSCs活化過程中伴有其自噬水平的升高，若抑制HSCs自噬將顯著抑制其活化。Hernández-Gea等[9]發現自噬作為細胞內大分子物質及細胞器，參與自我更新及能量代謝的重要生物學過程，在促進HSC中能量代謝并維持HSC活化狀態中發揮了重要作用。劉曼等[10]研究證實3-MA能影響HSC增殖活化，然而，乙醇刺激HSC后，HSC的活化水平如何，自噬水平是否會發生改變仍然未知。因此若能有效控制乙醇誘導的肝纖維化的發生，將為治療酒精性肝硬化發生帶來的新希望。

本研究所用的HSC-T6，系SV40轉染SD大鼠HSC而成，具有活化HSC的表型，能表達高水平的Ⅰ型膠原蛋白mRNA等，能檢測出自噬標志性蛋白LC3Ⅱ的表達，表明HSC-T6本身有一定的自噬水平。加入乙醇刺激后，自噬標志性蛋白LC3Ⅱ的表達增加，表明乙醇刺激HSC-T6后能增加其自噬水平。3-MA是自噬調控信號通路Ⅲ型PI3K（hVps34）抑制劑，能抑制胞質型LC3Ⅰ向自噬體膜蛋白LC3Ⅱ的轉化，從而抑制自噬水平[11]。本研究結果發現，3-MA作用HSC-T6后，自噬水平隨著劑量的增加而下降，而α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA及蛋白的表達量亦隨自噬水平的降低而相應的減少。這表明HSC自噬水平在維持其活化狀態中起到重要作用。為了明確自噬抑制劑對乙醇誘導的HSC的增殖情況，本實驗采用了MTT法檢測不同劑量的自噬抑制劑對乙醇誘導的HSC增殖水平，結果表明，3-MA能顯著抑制HSC的增殖，并隨著濃度的升高，其抑制效應越強。

然而，自噬抑制劑對乙醇誘導的HSC活化的抑制作用是通過何種途徑實現仍不明確。有研究表明，乙醇所致氧化應激是激活HSC的重要因素，過度攝入的乙醇及其代謝產物是引起肝臟內氧化應激的主要介質[12]，這些代謝產物可以直接攻擊HSC促其活化，也能通過誘導轉化生長因子（TGF）-β、p38、NF-κB、JNK等信號通路和AP-1、MAPK等炎癥信號通路激活HSC細胞[13-14]。

Komatsu等[15]發現，自噬基因atg7敲除后小鼠自噬水平顯著下降，并伴有P62大量積聚，P62可進一步同Nrf2競爭性結合Keap1，促使Nrf2與Keap1解偶聯并發生核轉位，激活Nrf2下游抗氧化反應元件ARE調控的抗氧化基因轉錄，從而保護細胞免受氧化應激損傷。即抑制自噬可通過上調P62水平發揮對Nrf2-keap1-ARE信號通路的活化作用來降低乙醇誘導的氧化應激水平。

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（2013-11-05收稿2014-03-07修回）

（本文編輯魏杰）

The Effects of Autophagy Inhibitor on Activation of Alcohol induced Hepatic Stellate Cells

HE Yue1,JIA Baohui1,LIU Man2,LUO Wen2,ZHANG Jixiang2
1Department of Intensive Care Unit,The Fourth Affiliated Hospital,Nanchang University,Nanchang 330003,China;2Department of Gastroenterology,The Second Affiliated Hospital,Jiangxi Province Key Laboratory of Molecular Medicine, Nachang University
ZHANG Jixiang，E-mail：jixiangz@tom.com

ObjectiveTo observe the effect of autophagy inhibitor on the activation of alcohol induced hepatic stellate cells,and the mechanisms thereof.MethodsHSC-T6 cells were cultured in vitro and divided into four groups,including blank control group,alcohol group,5 mmol/L 3-MA+alcohol group(low alcohol group)and 10 mmol/L 3-MA+alcohol group(high alcohol group).RT-PCR was used to detect the expression levels of α-smooth muscle actin(α-SMA)and typeⅠcollagen.The levels of LC3Ⅱ,α-SMA and typeⅠcollagen were detected by Western blot assay.The cell viability of HSCT6 was detected by MTT assay.ResultsThe mRNA expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and the protein of expressions α-SMA,typeⅠcollagen and LC3Ⅱwere significantly up-regulated in alcohol group compared with those of control group (P＜0.05),while the expressions of those parameters were significantly down-regulated in 10 mmol/L 3-MA+alcohol group (P＜0.01).The mRNA and protein levels of α-SMA and typeⅠcollagen were significantly decreased in two 3-MA-treated groups compared with those in alcohol group(P＜0.05).Meanwhile,compared with the 5 mmol/L 3-MA+alcohol group，the protein expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3Ⅱwere significantly decreased in10 mmol/L 3-MA+alcohol group (P＜0.05).Compared with the alcohol group，there was significantly lower proliferation activity in all two 3-MA-treated groups(P＜0.05).Conclusion3-MA can inhibit the protein expression of LC3Ⅱ,α-SMA and typeⅠcollagen induced by alcohol in HSC-T6 cells,and inhibit the proliferation of HSC cells.

autophagy;ethanol;liver cirrhosis,alcoholic;3-methyladenine;actins;collagen typeⅠ;hepatic stellate cells

R575，R34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.002

國家自然科學基金資助項目（30360037）

1南昌大學第四附屬醫院重癥醫學科（郵編330003）；2南昌大學第二附屬醫院消化科、江西省分子醫學重點實驗室

△通訊作者E-mail：jixiangz@tom.com