鈣敏感受體及緊密連接蛋白-14在草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織中的表達及意義

孫穩(wěn)王勤章丁國富

鈣敏感受體及緊密連接蛋白-14在草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織中的表達及意義

孫穩(wěn)1王勤章2△丁國富2

目的初步探討鈣敏感受體（CaSR）和緊密連接蛋白（Claudin）-14在腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織中的表達及意義。方法30只雄性SD大鼠隨機分為對照組和結(jié)石組各15只，采用1％乙二醇和2％氯化銨每日2 mL灌胃誘導制作大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型。免疫組織化學檢測CaSR蛋白表達；RT-PCR檢測Claudin-14 mRNA表達；Western-Blotting分別檢測CaSR和Claudin-14蛋白表達；全自動生化分析儀檢測2組大鼠腎功能、血及尿生化指標。結(jié)果光鏡下結(jié)石組有大量結(jié)石結(jié)晶形成，血清肌肝（Cr）、尿素氮（BUN）、24 h尿鈣及尿量較對照組升高（P＜0.01），2組間血鈣、尿pH差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)石組Claudin-14 mRNA及CaSR蛋白表達較對照組升高（P＜0.01），Claudin-14蛋白在結(jié)石組大鼠腎組織中呈特異性高表達，對照組未檢測到Claudin-14蛋白表達；結(jié)石組大鼠腎組織中CaSR 和Claudin-14蛋白表達呈正相關(guān)，同時，CaSR、Claudin-14蛋白表達與24 h尿鈣排泄量也呈正相關(guān)。結(jié)論CaSR和Claudin-14表達增高可通過增加尿鈣排泄量，進而參與結(jié)石的形成。

腎結(jié)石；草酸鈣；受體,鈣敏感；大鼠,Sprague-Dawley；緊密連接蛋白-14

泌尿系結(jié)石的形成是由多因素共同作用所致，其病理機制目前尚不明確。研究表明：尿鈣排泄增高是誘發(fā)或促進含鈣尿路結(jié)石形成的一個重要危險因素[1]。鈣敏感受體（calcium-sensing receptor,CaSR）是近年來發(fā)現(xiàn)的與尿鈣排泄顯著相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體，其可通過上調(diào)髓袢升支粗段（thick ascendinglimb，TAL）緊密連接蛋白-14（Claudin-14）的表達抑制腎小管對鈣離子的重吸收[2]，從而增加尿鈣排泄。因此，筆者推測CaSR和Claudin-14可能在泌尿系含鈣腎結(jié)石形成過程中發(fā)揮重要生理學作用。本研究通過構(gòu)建大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型來初步探討CaSR 和Claudin-14在結(jié)石大鼠腎組織中的表達變化及其與尿鈣排泄的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實驗動物。8周齡SD雄性大鼠30只購于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g。（2）主要試劑和儀器。乙二醇、氯化銨（Sigma，美國），小鼠抗CaSR抗體（Abcom，美國），兔抗Claudin-14抗體（Santa Cruz，美國），山羊抗小鼠二抗lgG、山羊抗兔二抗lgG、PV6000通用型Polymer Kit試劑盒（北京中杉金橋），Trizol Reagent（Invitrogen公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，美國），PCR引物（上海生工生物工程公司），蛋白裂解液提取試劑盒RIPA（北京索萊寶科技有限公司），彩虹Marker（Termo Scientific公司，美國），Au1000自動生化分析儀（Olympus，日本），180-80型原子吸收分光光度計（Hitachi Limited，日本），PCR儀（TaKaRa，日本），mini垂直電泳槽，半干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-rad公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組和大鼠腎結(jié)石模型的構(gòu)建參照曹正國等[3]的方法制作大鼠腎結(jié)石模型。30只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為2組，各15只。對照組：自來水飲水，每日每只2 mL生理鹽水灌胃；結(jié)石組：含1％乙二醇自來水自由飲水，每日每只2 mL 2％氯化銨灌胃。大鼠適應性飼養(yǎng)3天，連續(xù)灌胃4周。

1.2.2 血、尿生化檢測實驗第28天收集實驗大鼠24 h尿液，進行24 h尿鈣含量測定。水合氯醛麻醉下腔靜脈穿刺取血4 mL，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清，檢測血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、Ca2+水平。

1.2.3 腎組織HE染色及CaSR免疫組織化學檢測連續(xù)灌胃4周后水合氯醛麻醉處死實驗大鼠，手術(shù)切取左腎，福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后切片行常規(guī)HE染色，普通光學顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學變化及腎小管區(qū)有無結(jié)石結(jié)晶，以判斷腎結(jié)石模型是否成功建立。另取腎組織切片，分步行脫蠟，抗原修復，血清封閉，滴加CaSR抗體（1∶750），4℃孵育過夜，DAB顯色，復染，透明，封片等，觀察CaSR免疫組織化學染色情況。

1.2.4RT-PCR法檢測腎臟組織Claudin-14mRNA表達Trizol法提取腎組織總RNA。紫外分光光度計測定提取的RNA A260/A280均在1.8～2.0之間，用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳確定RNA純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行Claudin-14 和GAPDH基因的PCR檢測。Claudin-14引物:上游5′-GACGAGGTGACTTCTCTGGC-3′，下游5′-ACACACCCTCTAGTGCAGGC-3′，產(chǎn)物大小242 bp。反應條件為：95℃5 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，35個循環(huán)，72℃10 min；GAPDH引物：上游5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，產(chǎn)物大小496 bp。反應條件為：95℃5 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)，72℃10 min，取4 μL PCR產(chǎn)物加1 μL的溴芬藍進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，并用Bio-rad凝膠成像分析系統(tǒng)分別計算Claudin-14、GAPDH mRNA的積分光密度值。

1.2.5Western-Blotting法檢測腎臟組織CaSR和Claudin-14表達取100 mg腎臟組織低溫研磨后，加入PMSF及蛋白裂解液（1∶100），冰上放置40 min，4℃下13 300 r/min離心40 min后取上清。以BSA為標準，用Bradford法對上清進行蛋白定量。取40 μg蛋白樣品，10％SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，37℃封閉液中封閉2 h；分別使用CaSR抗體（1∶500）和Claudin-14抗體（1∶500），4℃下孵育12 h。次日用TBST洗膜3次，每次20 min，加入相應的二抗（1∶20 000），室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次，每次20 min，ECL化學發(fā)光試劑顯色，顯影定影處理，Quantity one軟件分析圖像。以β-actin蛋白條帶為內(nèi)參照，結(jié)果用靶蛋白/β-actin表示。采用TBS-T液代替CaSR抗體或Claudin-14抗體孵育作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學方法采用Sigmstat 3.5統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血、尿生化檢測結(jié)果結(jié)石組血BUN、血Cr、尿量、24 h尿鈣排泄量高于對照組（P＜0.01），2組血鈣值均在正常范圍內(nèi)，差異無統(tǒng)計學意義。2組間24 h 尿pH差異亦無統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1 The biochemical indices in blood and urine in two groups表1 對照組和結(jié)石組大鼠血、尿液生化指標（n=15,±s）

Tab.1 The biochemical indices in blood and urine in two groups表1 對照組和結(jié)石組大鼠血、尿液生化指標（n=15,±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組結(jié)石組t 血BUN (mmol/L) 8.27±0.20 17.09±1.42 6.096＊＊血Cr (μmol/L) 40.05±1.54 72.95±3.99 7.689＊＊血鈣(mmol/L) 2.57±004 2.70±0.05 1.919組別對照組結(jié)石組t 尿pH 6.49±0.03 6.39±0.05 0.153 24 h尿量(mL) 13.20±0.55 21.27±1.08 6.646＊＊24 h尿鈣(mmol) 3.26±0.60 9.66±1.10 5.111＊＊

2.2 形態(tài)學觀察肉眼可見結(jié)石組腎組織腫脹，表面點狀分布黃白色結(jié)晶或鈣化，見圖1。HE染色可見結(jié)石組腎組織多數(shù)腎小管管腔內(nèi)彌漫散布無色透明、片狀結(jié)晶，皮質(zhì)多于髓質(zhì)，主要位于近曲小管和遠曲小管。腎小管上皮細胞明顯腫脹、變性、壞死，管腔內(nèi)可見嗜伊紅樣壞死物質(zhì)及部分脫落上皮細胞，腎間質(zhì)有炎性細胞侵潤，對照組無上述病理改變，見圖2。

Fig.1 Changes in appearance of rat kidney in two groups圖1 大鼠腎臟外觀變化

Fig.2 HE staining of rat kidney tissues in two groups圖2 大鼠腎組織HE染色（×200）

2.3 腎組織CaSR免疫組織化學結(jié)果2組腎小管上皮細胞均有不同程度的CaSR陽性表達，主要定位于細胞膜，呈棕褐色。結(jié)石組腎小管上皮細胞CaSR呈彌漫性表達且強度明顯高于對照組，見圖3。

Fig.3 The positive expression of CaSR in rat kidney tissues圖3 大鼠腎組織CaSR陽性表達（免疫組化×200）

2.4 腎組織Claudin-14 mRNA檢測結(jié)果結(jié)石組Claudin-14 mRNA高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（0.128±0.006 vs 0.039±0.007，t=13.899，P＜0.01），見圖4。

Fig.4 Changes of Claudin-14 mRNA/GAPDH expression in rat kidney tissues圖4 大鼠腎組織Claudin-14 mRNA/GAPDH表達變化

2.5 腎組織CaSR和Claudin-14 Western-Blotting結(jié)果結(jié)石組CaSR蛋白表達水平高于對照組（6.697± 0.051 vs 5.016±0.053，t=88.350，P＜0.05），Claudin-14蛋白表達水平亦高于對照組（1.520±0.010 vs 0，t= 198.00，P＜0.01），見圖5、6。結(jié)石組大鼠腎組織中CaSR和Claudin-14蛋白表達存在顯著正相關(guān)（r= 0.896，P＜0.01），因Claudin-14蛋白在對照組未見表達，故對照組未做相關(guān)性分析。

Fig.5 Expressions of CaSR/β-actin in rat kidney tissues detected by Western blot assay圖5 大鼠腎組織CaSR蛋白Western-Blotting檢測結(jié)果

Fig.6 Expressions of Claudin-14/β-actin in rat kidney tissues detected by Western blot assay圖6 2組大鼠腎組織Claudin-14蛋白Western-Blotting檢測結(jié)果

2.6CaSR和Claudin-14蛋白表達與24 h尿鈣排泄的相關(guān)性結(jié)石組大鼠腎組織中CaSR和Claudin-14蛋白表達與24 h尿鈣均呈正相關(guān)（r分別為0.878、0.934，均P＜0.01）。

3 討論

CaSR是G蛋白偶連血漿細胞膜受體家族中的一員[4]，近年來Loupy等[5]發(fā)現(xiàn)在TAL上有CaSR存在，且激活后可抑制TAL內(nèi)鈣的重吸收，從而證實CaSR可調(diào)節(jié)腎小管對鈣的重吸收。Claudin-14為緊密連接蛋白家族的一員，嚴格定位于腎臟的TAL[6]，可通過調(diào)節(jié)細胞旁途徑的緊密連接蛋白-16和緊密連接蛋白-19構(gòu)成的陽離子通道滲透性調(diào)節(jié)腎小管對鈣的重吸收[7-9]。Dimke等[2]通過激活小鼠腎組織中CaSR后，發(fā)現(xiàn)Claudin-14蛋白表達顯著增高，且尿鈣排泄也相應增加，證實CaSR在TAL主要是通過調(diào)節(jié)下游的Claudin-14蛋白表達來抑制鈣的重吸收，同時，腎臟TAL的Claudin-14表達主要受此處CaSR調(diào)控。尿液中游離鈣增高被認為是泌尿系含鈣結(jié)石形成的主要危險因素[10]，但結(jié)石大鼠腎組織中CaSR和Claudin-14表達變化如何，以及是否會增加尿鈣排泄目前尚不明確。

本研究顯示模型組大鼠腎小管中存在大量結(jié)石結(jié)晶，且尿鈣明顯高于對照組。免疫組織化學染色及Western-Blotting均證實腎結(jié)石大鼠腎組織中CaSR及Claudin-14蛋白表達均高于對照組，兩者間存在正相關(guān)。Western-Blotting檢測可見腎臟中表達的CaSR呈現(xiàn)出分子質(zhì)量分別為130 ku和55 ku的兩條帶，其中130 ku是成熟形式，其C末端由復雜的碳水化合物糖基化，而55 ku是非成熟形式，為非糖基化形式。目前認為，只有其成熟形式作為受體存在于細胞膜上發(fā)揮生理學作用，但只占CaSR的一小部分，本文檢測到的55 ku條帶密度明顯高于130 ku，與國內(nèi)外文獻一致[11]。同時，CaSR和Claudin-14蛋白表達與尿鈣排泄水平也存在正相關(guān)。此外，本研究還證實在腎結(jié)石大鼠腎組織中Claudin-14蛋白特異性高表達，而在正常組無表達。由此推測：在模型組腎組織中CaSR和Claudin-14高表達可能參與了腎結(jié)石的形成，其機制可能是CaSR激活腎組織中Claudin-14表達，進而通過影響TAL上皮細胞膜上離子通道的滲透性，抑制尿中鈣離子的重吸收，促進尿鈣排泄[2]，增加腎小管中結(jié)石結(jié)晶的形成的風險，但具體調(diào)節(jié)機制有待深入研究。

Gong等[12]研究發(fā)現(xiàn)Claudin-14基因在正常腎臟中不表達，通常在飲水過少或攝入鈣過多時表達，通過分析腎臟中微小的非編碼RNA，發(fā)現(xiàn)在CaSR下游有一個microRNAs（miR-9，miR-374）基礎(chǔ)信號通路，它直接管控Claudin-14的表達及建立Claudin-14分子機制作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)器來保持腎臟鈣離子平衡。本研究也發(fā)現(xiàn)：Claudin-14 mRNA在對照組和結(jié)石組腎組織均有表達，且結(jié)石組表達水平顯著高于對照組，而Claudin-14蛋白在結(jié)石組顯著增高，在對照組不表達，推測Claudin-14蛋白在結(jié)石腎組織中表達變化有可能是由于體內(nèi)結(jié)石形成因素上調(diào)CaSR后，通過調(diào)控microRNAs信號通路激活Claudin-14的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯，進而促進小管上皮細胞合成Claudin-14蛋白[13]。

綜上，在高鈣尿性腎結(jié)石形成過程中可能存在一個CaSR-Claudin-14調(diào)控通路，其可通過促進尿鈣排泄參與泌尿系含鈣結(jié)石的形成，其中CaSR可能是通過激活Claudin-14的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯發(fā)揮作用。

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（2013-11-04收稿2014-03-17修回）

（本文編輯李國琪）

Expressions of CaSR and Claudin-14 in Renal Calcium Oxalate Stone Model of Rats

SUN Wen1,WANG Qinzhang2,DING Guofu2
1Medical College of Shihezi University,Xinjiang 832000,China;2 Department of Urology,The First Affiliated Hospital of Medical College in Shihezi University
WANG Qinzhang,E-mail:wqz1969@sina.com.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of calcium sensitive receptor(CaSR)and tight junction protein (Claudin)-14 in renal calcium oxalate stone rat model.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into control group(n=15)and model group(n=15).The rat model of renal calcium oxalate stone was established by gavaging 1％glycol(2 mL/d)and 2％ammonium chloride.The expression of CaSR protein was detected using immunohistochemical assay.RTPCR was used to detect the Claudin-14 mRNA expression.The expression levels of CaSR and Claudin-14 protein were detected by Western blot assay respectively.The full automatic biochemical analyzer was used to detect rat renal function and changes of blood and urine biochemical indices.ResultsA large stone crystallization was observed under light microscope in model group.The serum levels of Cr,BUN,24-h urine calcium and urine volume were significantly higher in model group than those of control group(P＜0.01).There were no significant differences in serum calcium level and urinary pH value between two groups.The expression levels of Claudin-14 mRNA and CaSR protein were significantly higher in model group than those of control group(P＜0.01).The Claudin-14 protein expression was specifically higher in renal tissues of model group.There was no Claudin-14 protein expression in control group.There was a positive correlation between CaSR and Claudin-14 protein expression in renal tissues of model group.Also,CaSR and Claudin-14 protein expressions were positively correlated with the 24-h urine volume.ConclusionThe increased expressions of CaSR and Claudin-14 involved in the formation of kidney stone by increasing the urinary calcium excretion.

kidney calculi;calcium oxalate;receptors,calcium-sensing;rats,Sprague-Dawley;Claudin-14

R692.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.009

國家科技支撐計劃項目（2013BAI05B05）

1石河子大學醫(yī)學院（郵編832000）；2石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科

△通訊作者E-mail:wqz1969@sina.com.cn