測序技術在缺失型脊髓性肌萎縮癥基因診斷中的應用

孟英韜 舒劍波

測序技術在缺失型脊髓性肌萎縮癥基因診斷中的應用

孟英韜 舒劍波

目的探索將測序技術應用于缺失型脊髓性肌萎縮癥（SMA）基因診斷的可行性。方法設計2對引物，PCR擴增SMA致病基因運動神經元生存基因（SMN1）與其同源基因SMN2之間5個不同堿基所在區域，第1對引物正向擴增SMN1內含子6至7間長度為501 bp片段，包含4個不同堿基位點g.31957、32006、32154及32269；第2對引物反向擴增SMN1外顯子8區域，長度為189 bp，包含1個不同堿基位點g.32734。根據測序圖譜區分SMA患者與攜帶者和（或）正常人。將此方法應用于7個臨床疑似SMA家系的診斷，并與聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）法進行比較。結果6例測序圖譜顯示SMN內含子6至外顯子8之間5個SMN1和SMN2差異位點g.31957、32006、32154、32269及32734均只有SMN2特有堿基a、T、g、g和A，患兒父母（攜帶者）相同位點顯示為a/g、T/C、g/a、g/a和A/G。說明患者缺失SMN1基因，缺失范圍包括內含子6至外顯子8；攜帶者則既有SMN1基因，又有SMN2基因，與患者能區分開。1例檢測結果為a、T、g、g和A/G，說明其缺失范圍不含外顯子8。測序法與PCR-RFLP方法結果一致。結論測序技術在缺失型SMA患者的基因診斷上優于經典PCR-RFLP法，更方便快捷，結果更明確，建議替代常用的PCR-RFLP法。

脊髓性肌萎縮,兒童；序列分析,DNA；多態性,限制性片段長度；基因診斷；SMN基因

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是兒科最常見的常染色體隱性遺傳的神經系統遺傳病之一，活嬰中發病率約（1～1.7）/10 000，攜帶者頻率約1/35～1/50[1]。患兒脊髓前角α細胞退行性變，四肢近端和軀干肌肉無力萎縮，嚴重者可致死。其致病原因為運動神經元生存基因（survival motor neuron，SMN）缺失。人類SMN有SMN1和SMN2 2種高度同源拷貝，兩者僅有5個堿基差異，位于內含子6至外顯子8之間。95％的SMA都存在SMN1外顯子7純合缺失，其余5％有基因內點突變。聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）法在SMA基因診斷中應用廣泛，沿用至今[2-3]。隨著分子生物技術的發展，測序技術逐漸應用于臨床，本文設計2對引物將5個SMN1與SMN2不同位點包含其中，通過測序觀測5個位點是否均為SMN2基因所特有，探討此方法檢出SMA患者的可行性，為SMA基因診斷提供一新的途徑。

1 對象與方法

1.1 研究對象2012年11月—2013年6月我院就診的7例臨床診斷疑似SMA患兒及其父母，男5例，女2例，年齡2個月～3歲，均簽署基因診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集抽取患者及父母外周血2～3 mL，EDTA抗凝，鹽析法提取基因組DNA，溶解于TE液，DNA純度和濃度均經核酸定量儀（Nanodrop 2000，美國）檢測，-70℃冰箱保存。

1.2.2 引物設計參照GenBank中SMN1/SMN2基因序列（NG_008691.1、NG_00 8728.1），采用Gene Runner 3.04軟件設計引物1,擴增長度501 bp，從SMN基因g.31844～g.32344，用于檢測SMN1/SMN2內含子6與內含子7之間4個不同位點，分別位于g.31957、32006、32154、32269。SMN1/SMN2外顯子8的不同位點g.32734距以上4個位點距離較遠，故參考文獻[4]用引物2單獨擴增，擴增長度189 bp，從SMN基因g.32666～g.32854，由于差異位點距下游引物較遠，所以采用反向測序，引物序列見表1。SMN1基因g.31957、32006、32154、32269、32734這5個不同堿基位置的種類分別為g、c、a、a、G，SMN2基因5個不同堿基的種類分別為a、T、g、g、A（大寫寫字母代表位于外顯子，小寫字母代表位于內含子）。

Tab.1 Primers for identification of SMN1/SMN2表1 鑒別SMN1/SMN2引物

1.2.3PCR擴增采用60 μL反應體系，基因組DNA用量約為250 ng。PCR反應條件：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個循環。PCR產物經2％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統判定擴增結果。

1.2.4DNA測序委托金唯智生物技術公司完成。測序結果判定：正常人或攜帶者同時含有SMN1和SMN2，5個差異堿基位點g.31957、32006、32154、32269和g.32734顯示為a/g、T/C、g/a、g/a和A/G，而由于SMN1缺失造成的SMA患者僅有SMN2基因，在特定位置僅出現SMN2特有堿基，即僅顯示為a、T、g、g和A，由此可檢出缺失型SMA患者。

1.2.5PCR-RFLP法位于SMN外顯子7的g.32006是基因診斷SMA關鍵位點，此位點如沒有SMN1特異堿基C即可診斷為缺失型SMA；位于SMN外顯子8的g.32734對檢出SMN1外顯子8的缺失有輔助作用。PCR-RFLP法通過PCR與酶切兩個步驟檢測SMN外顯子7 g.32006與外顯子8 g.32734位點來檢出SMA患者。SMN外顯子7 g.32006的檢測：先用錯配引物擴增SMN外顯子7，再用限制性內切酶DraⅠ將SMN2切成164和23 bp 2片段，SMN1缺乏DraⅠ酶切位點不能被酶切，SMN1缺失型患者電泳圖上僅出現SMN2被酶切后的164 bp條帶，攜帶者與正常人出現187和164 bp 2條帶。SMN外顯子8 g.32734的檢測：SMN2外顯子8序列存在DdeⅠ酶切位點，SMN1無此酶切位點，兩者可借此區分，電泳圖上出現188、125與63 bp 3條帶的SMN1的外顯子8不缺失，僅出現125 bp與63 bp 2條帶的SMN1的外顯子8缺失，詳見文獻[4]。

2 結果

2.1 患兒與攜帶者內含子6 g.31957位點的差異患兒該位點為a，攜帶者為a/g，說明患兒該位點僅含SMN2基因，攜帶者既含SMN1又含SMN2基因，見圖1。

Fig.1 Sequencing analysis of SMN g.31957 in intron 6圖1 SMN基因內含子6 g.31957位點測序結果

2.2 患兒與攜帶者外顯子7 g.32006位點的差異患兒該位置為SMN2基因所含的T，攜帶者該位置呈T/C，可以判定患兒此位置SMN1基因缺失，見圖2。

2.3 患兒與攜帶者內含子7 g.32154和g.32269位點的差異從測序圖譜中可看到患兒內含子g.32154 和g.32269位點均為g，提示僅含SMN2基因，見圖3a、b；攜帶者g.32154和g.32269位點均為a/g，既含SMN1又含SMN2，見圖3c、d。說明患兒SMN1缺失區域包括內含子7。

Fig.2 Sequencing analysis of SMN g.32006 in exon 7圖2 SMN基因外顯子7 g.32006位點測序結果

Fig.3 Sequencing analysis of SMN g.32154 and g.32269 in intron 7圖3 SMN基因內含子7 g.32154和g.32269位點測序結果

2.4 患兒與攜帶者外顯子8 g.32734位點的差異患兒反向測序圖譜此位點為T，說明僅含SMN2基因的A堿基；攜帶者反向測序圖譜為C/T，說明同時含SMN1和SMN2基因，由此判定患兒此位置SMN1基因缺失，見圖4。

通過2段基因測序清楚顯示6例患兒SMN1在內含子6至外顯子8區間發生缺失，5個位點均僅含SMN2基因；還檢出1例患兒g.32734反向測序圖譜為C/T，其余4點僅含SMN2基因，屬于SMN1外顯子7缺失但外顯子8不缺失患者。

2.5PCR-RFLP法診斷SMA患兒與攜帶者的區別患兒SMN外顯子7經DraⅠ內切酶酶切后呈1條帶，攜帶者呈2條帶；患兒SMN外顯子8經DdeⅠ內切酶酶切后呈2條帶，攜帶者呈3條帶；見圖5。兩種方法均可將SMA患者與攜帶者區分開來，證實PCR-RFLP檢測結果與測序結果一致。

Fig.4 Sequencing analysis of SMN g.32734 in exon 8圖4 SMN基因外顯子8 g.32734位點測序結果

Fig.5 The electrophoresis of PCR-RFLP in molecular diagnosis of patients with SMA圖5 PCR-RFLP法診斷SMA患者電泳圖

3 討論

3.1 幾種SMA現有基因診斷方法比較SMA是發病率較高的神經肌肉遺傳病，基因診斷方法是確診的金標準。目前最新的基因診斷方法有MLPA[5]、DHPLC[6]及熒光定量PCR[7-8]，這些方法雖然能檢出攜帶者，但由于價格昂貴、需要特殊儀器等原因，尚不適于臨床應用，尤其是基層實驗室。本院自2002年開展SMA基因診斷項目以來，一直采用PCRRFLP法，為近百例疑似者做過檢測。該方法使用錯配引物，PCR效率可能受到影響，結果不夠穩定；如遇酶活力降低、酶切不完全時可能出現假陰性；電泳圖譜目標帶與對照帶僅相差20 bp，有時結果難于判定。

3.2DNA測序技術的優勢近年來基因測序技術發展迅速，從價格到時間逐步適合臨床應用。本文依據SMA致病原因的特點設計選取2對引物，通過擴增結合測序，能清晰分辨SMN1外顯子7和（或）外顯子8純合缺失型SMA患者，由于采用5個位點的圖譜分析，提高了結果的準確度，避免了假陰性和假陽性。實驗步驟簡便，僅需PCR擴增與一代測序。曹延延等[9]采用類似方法僅對前4個位點進行了檢測，不能檢測出外顯子7缺失但外顯子8不缺失的患者，此類患者雖占比例較小，但屬于SMN1轉化成SMN2造成的SMA，與純缺失型的SMA致病機制不同，應加以區分[9]。PCR-RFLP法僅能檢測外顯子7和（或）8是否發生缺失，無法了解缺失范圍是否涉及其他區域，而測序技術證實內含子6及內含子7也同時發生缺失，增加了對該病致病機制的了解。

3.3 本方法局限性本方法不能區分正常人與攜帶者，因為兩者在5個標志性位點均呈雜合狀態，另一局限是對點突變或位于1～6號外顯子上的缺失造成的SMA無法檢出[10]，這種類型在SMA患者中僅占約5％。

總之，測序技術用于缺失型SMA的基因診斷是一種值得推廣并可以取代PCR-RFLP的方法。

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（2013-11-08收稿2014-02-18修回）

（本文編輯李鵬）

Sequencing Technology in Molecular Diagnosis of Spinal Muscular Atrophy Caused by SMN1 Deletion

MENG Yingtao,SHU Jianbo
Pediatric Research Institute,Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300074，China

ObjectiveTo investigate the feasibility of DNA sequencing analysis in molecular diagnosis for spinal muscular atrophy(SMA).MethodsTwo pairs of primers were utilized to amplify the region including 5 different bases in SMA-causative gene SMN1 and its homologue copy SMN2 by polymerase chain reaction(PCR).The first primer amplified a fragment 501 bp long spanning from SMN intron 6 to intron 7 targeting four different bases(g.31957,32006,32154 and 32269).The second primer reversely amplified a 189 bp long fragment within SMN exon 8 including one base-pair difference(g.32734).PCR procedure was followed by Sanger sequencing technique to identify the 5 different bases.SMA patients caused by SMN1 homozygous deletion were distinguished from carriers or normal controls by absence of SMN1 specific bases in sequence chromatograms.This assay was performed in 7 SMA suspected patients and their parents.The specimens were also detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(RFLP)method.ResultsIt was found that 6 of 7 SMA suspected patients showed only SMN2 specific bases at the 5 different base positions among the region from intron 6 to exon 8,which meant the patient displaying only SMN2-specific nucleotide a,T,g,g and A at g.31957,32006,32154,32269 and 32734,while their parents(carriers)showed a/g,T/C,g/a,g/a and A/G at the same sites.SMN1 gene was deleted in the patient,and the deletion region was inferred from intron 6 to exon 8.Because carriers had both SMN1 and SMN2 genes,they can be discriminated from the SMN1 deleted patient.One of 7 patients yield an unique sequence chromatogram of a,T,g,g and A/G,indicating that exon 8 of SMN1 was not deleted in this patient.ConclusionDNA sequencing analysis is an alternative simple method for detecting SMA caused by homozygous deletion of SMN1.We recommend to replace the widely used PCR-RFLP method with DNA sequencing assay.

spinal muscular atrophies of childhood；sequence analysis,DNA；polymorphism,restriction fragment length；genetic testing；SMN gene

R746.4，R725.962

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.021

天津市衛生局科技基金資助項目（2011KZ34）

天津市兒童醫院兒科研究所（郵編300074）