Hedgehog信號通路在腎透明細胞癌中的表達及作用

李曉明楊春雨關有良

Hedgehog信號通路在腎透明細胞癌中的表達及作用

李曉明1楊春雨2關有良3

目的 研究人腎透明細胞癌（RCCC）中Hedgehog信號通路相關因子Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達，探討Hedgehog信號轉導通路的異常激活與RCCC的關系。方法應用免疫組織化學方法檢測76例RCCC標本及12例癌旁正常腎組織，應用蛋白免疫印跡技術檢測10例新鮮癌組織及癌旁正常腎組織中Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達。結果Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白在RCCC中的異常表達率（分別為52.6％、63.2％、44.7％、60.5％）高于正常腎組織(分別為8.3％、16.7％、8.3％、25.0％)。且其表達與患者的年齡、性別和腫瘤大小無顯著相關，而與腫瘤臨床分期有關，隨腫瘤的惡性程度加重，表達率增加。結論Hedgehog信號轉導通路在RCCC中呈現高度激活狀態，此通路的激活可能與RCCC的發生、發展密切相關，有望成為治療RCCC的靶點。

腎透明細胞癌；Hedgehog信號通路；免疫組織化學；印跡法，蛋白質

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于腎實質泌尿小管上皮的惡性腫瘤。腎透明細胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)是最常見的成人腎腫瘤，約占RCC的80％。Hedgehog（Hh）信號傳導通路是一個高度保守的調控胚胎發育的信號通路，對胚胎發育及細胞的生長和分化都有重要調控作用[1]。此信號通路的功能異常會導致各種先天性畸形和腫瘤[2]。有學者認為Hh信號通路的分子蛋白可以作為特異性治療癌癥的靶點[3]。Hh信號通路正逐漸成為信號轉導領域新的研究熱點，但目前國內外關于Hh信號轉導通路與RCCC發生關系的研究相對較少。本研究通過免疫組化及蛋白免疫印跡技術檢測Hh信號通路相關因子Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達，旨在探討Hh信號轉導通路的異常激活與RCCC之間的關系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集遼寧醫學院附屬第一醫院2005年1月—2013年12月手術治療、資料完整的腎透明細胞癌石蠟組織標本76例及12例癌旁正常腎組織標本。術前所有患者均未經放療和化療。其中男46例，女30例；年齡45～76歲，平均（60.24±4.31）歲。腫瘤分期依據美國癌癥聯合會(2002AJCC)的分期標準，Ⅰ期38例，Ⅱ期22例，Ⅲ期～Ⅳ期16例。10例新鮮腎透明細胞癌及癌旁組織來自同一醫院2011年1月—2013年12月手術切除標本。

1.2 實驗試劑 Shh兔多克隆抗體，Ptch羊多克隆抗體，Smo兔多克隆抗體和Gli1兔多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin鼠單克隆抗體購自北京中杉金橋生物制品有限公司，SABC試劑盒購自武漢博士德生物制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 石蠟切片厚5 μm，脫蠟水化，3％H2O2孵育，微波修復，于BSA室溫孵育，分別滴加兔多克隆抗體Shh（1∶50）、羊多克隆抗體Ptch（1∶50）、兔多克隆抗體Smo （1∶50）和兔多克隆抗體Gli1（1∶50）濕盒中4℃過夜。二抗37℃溫箱20 min，SABC 37℃溫箱30 min，DAB顯色，蘇木素復染細胞核。

1.3.2 Western Blotting測定 在10例新鮮腎透明細胞癌及癌旁組織中加入裂解液，剪碎、離心，考馬斯亮藍法蛋白質定量，上樣，電泳，轉膜，封閉，分別滴加一抗Shh（1∶300），Ptch （1∶300）、Smo（1∶300）、Gli1（1∶300）和β-actin（1∶400）4℃過夜，與二抗室溫下孵育1 h，ECL顯色。應用FluorchemⅤ2.0系統進行吸光度測定。

1.3.3 結果判定 以陽性細胞數百分比結合染色強度計分做定性分析[4]。任意選取10個高倍視野，計數200個細胞。（1）計數陽性細胞百分比。0級：0～5％；1級：＞5％～25％；2級：＞25％～50％；3級：＞50％。（2）根據陽性細胞的染色強度。0級：陰性；1級：淺黃色；2級：棕色；3級：深棕色。兩項評分結果相加。0分、1～2分、3～4分和5～6分分別對應陰性、+（低表達）、++（中度表達）和+++（強表達）。本研究將++/+++判定為異常表達。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果 Shh、Ptch和Smo蛋白主要表達在細胞的胞質或胞膜，Gli1蛋白主要表達在胞核。Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白在RCCC組織中的異常表達率高于癌旁正常腎組織（P＜0.05），見圖1、表1。

Tab.1 Expression of Hedgehog signaling pathway in RCCC and normal kidney tissues表1 Hedgehog信號通路相關因子在腎透明細胞癌及正常腎組織中的表達 例（％）

2.2 Hedgehog信號通路相關因子的表達與臨床病理特征的關系 不同年齡、性別、腫瘤大小RCCC患者的Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白異常表達率差異無統計學意義，Ⅲ～Ⅳ期患者的Shh、Ptch、Smo、Gli1蛋白異常表達率高于Ⅰ～Ⅱ期者（P＜0.05），見表2。

2.3 Western Blotting結果 Shh、Ptch、Smo和Gli1在腎透明細胞癌中的表達均明顯高于正常腎組織（P＜0.05），見圖2。

3 討論

Hh信號通路是人類胚胎發育過程中調控細胞增殖和分化的重要信號通路。研究顯示，Hh基因過度表達或者靶基因突變，可通過誘導細胞增殖、阻斷細胞凋亡等參與腫瘤的發生和發展[5]。此外，Hh信號通路在腫瘤干細胞自我更新、細胞持續分化以及腫瘤侵襲轉移等方面同樣發揮重要作用。

Hh信號通路主要包括配體Shh、跨膜蛋白受體Ptch和Smo組成的受體復合物以及下游轉錄因子Gli。Hh信號通路的效應串聯始于靶細胞中配體Shh與Ptch的結合。在機體處于正常狀態時，Ptch可以抑制Smo的活性。反之，當Shh配體過度表達，與Ptch結合，就可以使Ptch快速分解，解除其對Smo的抑制，釋放Smo進入細胞內。活化的Smo促使在細胞質微管上附著的Hh復合物（HSC）發生超磷酸化，Gli與HSC脫離，進入細胞核，導致其下游核轉錄因子Gli1激活，從而進一步激活下游靶基因的轉錄[6]。Gli蛋白家族是Hh信號轉導通路下游末端的重要轉錄因子，其表達水平的高低是Hh通路激活程度的標志[7]。

國內外文獻報道，經典的Hh信號傳導通路與腫瘤有關，如在胰腺癌、小細胞肺癌、前列腺癌、肝癌、基底細胞癌、髓母細胞瘤和神經膠質瘤等多種腫瘤中均有異常表達[8]。本研究結果顯示，RCCC組織中的Shh、Ptch、Smo及Gli 1蛋白異常表達率分別為52.6％、63.2％、44.7％及60.5％，明顯高于正常腎組織，提示在RCCC中確實存在Hh信號通路的異常激活，推測Hh信號通路參與了RCCC的發生和發展。此外，結果表明Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達與患者的年齡，性別和腫瘤大小無關，與腫瘤臨床分期有關，隨腫瘤的惡性程度加重，其表達率增加，提示Hh信號通路相關因子可能會作為一種診斷RCCC的生物學標志物。Hh信號通路與許多調控細胞增殖分化的其他信號通路如Notch、Wnt、Ras/ ERK等都有交叉作用。因此當Hh傳導通路被激活，可能與多基因、多信號系統、多因素共同作用，參與了腎細胞癌的發生和發展。

Fig.1 Expression of Hedgehog signaling pathway in RCCC（×400）圖1 Hedgehog信號通路相關因子在腎透明細胞癌中的表達（×400）

Tab.2 Expression of Hedgehog signaling pathway in RCCC and their relationship with clinicaopathologic factors表2 Hedgehog信號通路在腎透明細胞癌中的表達與臨床病理特征的關系 例（％）

Fig.2 Western blotting analysis of Shh,Ptch,Smo and Gli1 in RCCC圖2 Shh、Ptch、Smo和Gli1在腎透明細胞癌中的Western Blotting分析

[1]Barakat MT,Humke EW,Scott MP.Learning from Jekyll to control Hyde:Hedgehog signaling in development and cancer[J].Trends Mol Med,2010,16(8):337-348.doi:10.1016/j.molmed.2010.05.003.

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[3]An SM,Ding QP,Li LS.Stem cell signaling as a target for novel drug discovery:recent progress in the WNT and Hedgehog pathways[J].Acta Pharmacol Sin,2013,34(6):777-783.doi:10.1038/aps.2013.64.

[4]Liao X,Siu MK,Au CW,et al.Aberrant activation of hedgehog signaling pathway in ovarian cancers:effect on prognosis,cell invasion and differentiation[J].Carcinogenesis,2009,30(1):131-140.doi: 10.1093/carcin/bgn230.

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（2014-06-02收稿 2014-07-25修回）

（本文編輯 閆娟）

Expression and Role of Hedgehog Signaling Pathway in Renal Clear Cell Carcinoma

LI Xiaoming1,YANG Chunyu2,GUAN Youliang3
1 Department of Histology and Embryology,Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,China;2 Department of Pathology of the First Affiliated Hospital；3 Department of Urinary Surgery of the First Affiliated Hospital

ObjectiveTo investigate the expression of Shh,Ptch,Smo and Gli1 proteins who belongs to components of Hedgehog signaling pathway,and to explore the relationship between the abnormal activated of Hedgehog signaling pathway with renal clear cell carcinoma(RCCC).MethodsProtein expressions were examined by immunohistochemistry in 76 cases of human RCCC and 12 pericarcinomatous tissues.And 10 fresh specimens from cancer tissues and pericarcinomatous tissues were used to examine expressions of Shh,Ptch,Smo and Gli1 by Western blotting.ResultsThe expressions of examined proteins were higher in RCCC than that in pericarcinomatous tissue.Shh(52.6％vs 8.3％),Ptch(63.2％vs 16.7％), Smo(44.7％vs 8.3％)and Gli1(60.5％vs 25.0％).The increased proteins levels were disassociated with age,gender,and tumorous size in RCCC.But it was significantly correlated with TNM stage of RCCC.The expressions were gradually increased with higher TNM stage of RCCC or more invasive malignancy.ConclusionHedgehog signaling pathway is highly activated in RCCC.It might be involved in initiation,progression of RCCC,and it might be used as the target for RCCC treatment.

renal clear cell carcinoma;Hedgehog signaling pathway;immunohistochemistry;blotting,Western

R737.11

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.014

遼寧省自然科學基金項目（20120141）；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃（LJQ2013092）；遼寧醫學院博士啟動（Y2011B02）

1遼寧醫學院組織胚胎學教研室（郵編121001）；2遼寧醫學院附屬第一醫院病理科，3泌尿外科