下調microRNA-1對H2O2誘導的心肌細胞損傷的保護作用

鄭君毅 蔡 英 叢洪良Δ 周 津

細胞與分子生物學

下調microRNA-1對H2O2誘導的心肌細胞損傷的保護作用

鄭君毅1蔡 英2叢洪良1Δ周 津1

目的 研究下調microRNA（miRNA，miR）-1在H2O2誘導的心肌細胞損傷中的保護作用及其機制。方法將大鼠H9c2心肌細胞株分為4組，Blank組、NC組、H2O2組和H2O2+AS-miR-1組。Blank組不做任何處理，NC組細胞轉染隨機合成的miRNA陰性對照片段；H2O2組和H2O2+AS-miR-1組分別為不轉染和轉染miR-1 inhibitor（AS-miR-1）的H2O2細胞損傷組。采用定量PCR方法檢測各組miR-1表達水平，MTT和流式細胞術檢測細胞生存率和凋亡情況，利用生物信息學預測miR-1的靶基因，熒光定量PCR和Western Blot的方法檢測靶基因Bcl-2的mRNA和蛋白表達情況。結果Blank組和NC組相比較，各個指標差異均無統計學意義。H2O2組細胞的miR-1 mRNA表達水平顯著升高，生存率降低，凋亡增加，Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低。轉染AS-miR-1，可以降低H2O2誘導的心肌細胞損傷，提高細胞生存率，降低細胞凋亡率，上調Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平。結論下調miR-1表達可以通過升高凋亡抑制因子Bcl-2的表達水平降低H2O2誘導的心肌細胞凋亡，發揮心肌細胞保護作用。

微RNAs；肌細胞，心臟；細胞凋亡；轉染；氧化性應激；過氧化氫；miR-1

氧化應激是機體氧化和抗氧化不平衡的一種狀態，是引起心肌細胞損傷、心血管系統結構功能異常的重要原因之一，與多種心血管系統疾病密切相關[1]。MicroRNA（miRNA，miR）是一類具有負性調節作用的內源性小RNA，參與組成RNA誘導沉默復合體（RISC），通過剪切或抑制mRNA的翻譯抑制基因的表達。miRNA可調節細胞分化、增殖、凋亡等，參與腫瘤、心臟疾病、神經系統疾病的生理和病理過程。miR-1是近幾年發現的與心血管系統疾病關系最為密切的miRNA，在急性心肌梗死[2-3]、缺血再灌注[4]、心律失常[5]等疾病中都檢測到高表達的miR-1。本研究旨在建立H2O2誘導的心肌細胞氧化應激模型，觀察下調miR-1對心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 大鼠心肌細胞株H9c2購自中科院上海細胞庫。RNA提取試劑Trizol、DEPC水、逆轉錄試劑、Platinum SYBR Green qPCR試劑盒、轉染試劑脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。DMEM培養基、胎牛血清和0.05％胰酶/EDTA購自美國Gibco公司。miR-1 inhibitor（AS-miR-1）和陰性對照片段購自上海吉瑪公司。Bcl-2和β-actin抗體購自天津聯星生物公司。ECL化學發光試劑盒為millipore公司產品。FITC Annexin V凋亡試劑盒和流式細胞儀為BD公司產品，電泳系統和定量PCR儀為伯樂公司產品。

1.2 大鼠心肌細胞的培養 H9c2細胞用含10％胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5％CO2培養箱內培養，每隔2～3 d細胞傳代1次。在實驗前24 h將生長狀態良好的細胞換液備用。

1.3 細胞分組和轉染 實驗分為4組。（1）Blank組：不做任何處理的正常H9c2細胞。（2）NC組：細胞轉染隨機合成的miRNA片段作為陰性對照。（3）H2O2組：細胞培養液中加入H2O2，使其終濃度為0.1 mmol/L，建立氧化應激細胞模型。（4）H2O2+AS-miR-1組：細胞轉染miR-1 inhibitor（AS-miR-1）片段，然后加入終濃度為0.1 mmol/L的H2O2。根據miRNA產品使用說明，在轉染前，將miR-1 inhibitor和轉染試劑脂質體Lipofectamine 2000用不含血清的培養基Opti-MEM分別稀釋，室溫孵育5 min，然后將兩者輕輕混勻，室溫下孵育20 min。將miR-1 inhibitor-lipo 2000混合液加入細胞培養液中，混勻后置于37℃、5％CO2培養箱中繼續培養。24 h后收集各組細胞進行檢測。

1.4 RT-PCR檢測miR-1表達 將處理24 h后的各組細胞分別用Trizol提取細胞總RNA并進行逆轉錄。用SYBR Green qPCR試劑盒分別進行miR-1和U6的熒光定量PCR擴增，其中U6為內參，對各組的miR-1表達進行校準。PCR反應體系為20μL，包括2μL的cDNA，上下游引物各1μL，SYBR Green qPCR試劑10μL，其余為ddH2O。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，進行40個循環。miR-1相對表達量的計算：△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，以公式2-△Ct計算所得值表示miR-1相對表達量。實驗重復3次。

1.5 MTT實驗 將處于對數生長期的細胞以合適的細胞密度接種于96孔板中，培養24 h后根據上述分組情況對各組細胞進行不同的處理，每組設6個復孔，另設6個調零孔即只加細胞培養液的孔。繼續培養24 h后進行MTT實驗。設Blank組的細胞生存率為100％，實驗組細胞生存率（％）=實驗組吸光度（A）值/Blank組A值×100％。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組處于對數生長期的細胞按照1×105/孔接種于6孔板中，將轉染后24 h的各組細胞分別消化、離心、收集，PBS洗滌2次，離心去上清。向收集到的細胞沉淀中加入200μL binding buffer并吹打成單細胞懸液，加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI試劑，輕輕混勻后室溫避光放置15 min，進行流式細胞儀檢測。

1.7 靶基因Bcl-2 mRNA表達水平的檢測 Trizol一步法提取細胞總RNA并逆轉錄成cDNA，-20℃保存。用SYBR Green qPCR試劑盒分別進行目的基因Bcl-2和內參基因β-actin的熒光定量PCR擴增。PCR條件為：95℃預變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火45 s，擴增40個循環；72℃延伸5 min。計算目的基因Bcl-2的相對表達量。

1.8 Bcl-2蛋白表達水平的檢測 將轉染后24 h的各組細胞分別提取總蛋白，BCA法測蛋白定量。取40μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，電流大小分別為20 mA（濃縮膠）和40 mA（分離膠），電泳至指示劑到達凝膠底部時，停止電泳。根據蛋白Marker的分子質量大小，切取包含Bcl-2或β-actin條帶的凝膠，進行轉膜，轉膜條件為：冰浴下80 V，60 min。將NC膜放入5％脫脂奶粉中室溫封閉2 h，加入一抗（Bcl-2，1∶500稀釋；β-actin，1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。加入1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h。根據ECL化學發光試劑盒說明進行顯影，化學發光成像系統掃描吸光度值后用軟件分析Bcl-2蛋白表達水平。

1.9 統計學方法 應用SPSS 11.5統計軟件處理數據，計量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 定量PCR檢測miR-1結果 實時熒光定量PCR結果顯示，Blank組和NC組miR-1表達量較低，兩者比較差異無統計學意義。H2O2組細胞miR-1基因的表達水平明顯高于Blank組和NC組（P＜0.05），H2O2誘導細胞損傷的同時轉染miR-1 inhibitor能明顯降低H2O2引起的miR-1基因表達水平的上升（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison index between groups表1 各組細胞檢測指標結果比較 （±s）

Tab.1 Comparison index between groups表1 各組細胞檢測指標結果比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與Blank組比較，b與NC組比較，c與H2O2組比較，P＜0.05

組別Blank組NC組H2O2組H2O2+AS-miR-1組F n3333 miR-1的相對表達量0.66±0.14 0.71±0.16 2.34±0.74ab1.05±0.29c11.172＊＊細胞生存率（％）100.00±8.61 97.87±10.21 52.82±9.98ab79.09±12.56abc26.347＊＊組別Blank組NC組H2O2組H2O2+AS-miR-1組F n 3333細胞凋亡率（％）3.13±0.45 3.33±0.70 12.03±1.15ab8.43±1.94abc38.386＊＊Bcl-2 mRNA 2.38±0.13 2.39±0.15 1.82±0.11ab2.06±0.20ab9.721＊＊蛋白0.95±0.05 0.94±0.11 0.68±0.12ab0.87±0.09c5.314＊＊

2.2 MTT法檢測各組細胞生存率 與Blank組相比，NC組細胞的生存率無明顯變化，H2O2組明顯下降（P＜0.05）。轉染miR-1 inhibitor能提高H2O2損傷細胞的生存率，使其達到79.09％，與其他3組相比差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率 Blank組和NC組凋亡細胞較少，差異無統計學意義。H2O2組與Blank組和NC組相比，能明顯誘導細胞凋亡（P＜0.05）。H2O2+AS-miR-1組細胞凋亡率明顯低于H2O2組（P＜0.05），見表1、圖1。

Fig.1 Cell apoptosis rate in each group圖1 FCM檢測24 h后各組細胞凋亡率

2.4 各組Bcl-2 mRNA和蛋白的表達 Blank組和NC組Bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平差異無統計學意義。H2O2組Bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平明顯低于Blank組和NC組（P＜0.01）。H2O2+AS-miR-1 組Bcl-2 mRNA的表達水平與H2O2組比較差異無統計學意義，但低于Blank組和NC組（P＜0.05）。H2O2+AS-miR-1組Bcl-2的蛋白表達水平比H2O2組高（P＜0.05）；與Blank組和NC組比較差異均無統計學意義，見表1、圖2。

Fig.2 Western Blot of Bcl-2圖2 Western Blot檢測Bcl-2蛋白表達水平

3 討論

近年來，對miRNA的研究已經成為生命科學領域中的一個重要方向。miRNA是一類17～25 nt長的內源性非編碼單鏈小分子RNA，由一段具有發夾結構的70～80個核苷酸長度的單鏈RNA前體（pri-RNAs）在Dicer酶的剪切下生成。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA。miRNA在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性，通過部分互補或者完全互補結合到目的靶mRNA，特異性誘導靶基因mRNA降解和（或）抑制靶基因mRNA的翻譯，參與多種生物學信號通路的調節。miRNA分布范圍廣泛，參與的生物學過程復雜，調控的靶基因眾多。因此，研究miRNA的功能及作用機制有重要意義。

Zhao等[6]報道了miRNA在心臟發育中的關鍵作用，并提出miR-1具有肌細胞特異性，只在心肌和骨骼肌中表達。從此，miRNA在心血管領域的研究廣泛開展，大量文獻證實miRNA與心臟發育、心肌肥厚[7]、心律失常[5]、心肌纖維化、心力衰竭、心肌梗死、心肌梗死后血管生成[8]、動脈粥樣硬化[9]等具有密切的關系。其中，關于miR-1的研究成為心血管領域的熱點問題。高表達miR-1的細胞caspase-3活性升高、細胞凋亡明顯，但其具體的促凋亡機制還沒有完全闡明。針對不同的靶基因，miR-1作用的方式不同。研究表明miR-1不僅作用于抗凋亡因子HSP60/70的轉錄后水平，也作用于其轉錄水平，使得HSP60/70的蛋白和mRNA表達水平均降低，引起細胞凋亡；但對于靶基因IGF-1，miR-1僅在轉錄后水平發揮作用，使其蛋白表達水平降低，而mRNA表達水平無變化[10]。miR-1對caspase-3的蛋白和mRNA表達均沒有影響，只影響其活性，使其活性升高。

本課題組用targetscan和miRBase軟件預測到miR-1作用的一個重要靶基因為Bcl-2。前期工作顯示，利用轉染技術提高心肌細胞內的miR-1表達水平可以通過降低Bcl-2的mRNA和蛋白水平，引起細胞凋亡[11]。為了進一步研究miR-1在缺血心肌細胞凋亡中的作用，筆者用H2O2建立心肌細胞氧化應激損傷模型，觀察體外合成的miR-1 inhibitor對心肌細胞的保護作用。結果顯示，轉染miR-1 inhibitor能部分逆轉氧化應激引起的細胞凋亡現象，Bcl-2的蛋白表達水平明顯升高，mRNA表達水平雖然有升高趨勢，但與H2O2組差異無統計學意義。這一方面可能是由于研究樣本量太小，實驗誤差較大造成；另一方面可能也說明miR-1 inhibitor主要是通過作用于Bcl-2的蛋白水平發揮細胞保護作用。還需要進一步擴大樣本量進行驗證。

[1]孫桂波,王敏,高蒙蒙,等.龍牙楤木總皂苷對H2O2誘導乳鼠心肌細胞損傷的保護作用[J].中國藥理學通報,2013,29(6):773-777.

[2]Li C，Pei F，Zhu X,et al.Circulating microRNAs as novel and sensitive biomarkers of acute myocardial Infarction[J].Clin Biochem, 2012,45(10):727-732.doi:10.1016/j.clinbiochem.2012.04.013.

[3]Ai J，Zhang R，Li Y,et al.Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,391(1):73-77.doi:10.1016/j.bbrc.2009.11.005.

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[6]Zhao Y,Samal E,Srivastava D.Serum response factor regulates amuscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis[J]. Nature,2005,436(7048):214-220.doi:10.1038/nature03817.

[7]Wang K,Long B,Zhou J,et al.miR-9 and NFATc3 regulate myocardin in cardiac hypertrophy[J].J Biol Chem,2010,285(16): 11903-11912.doi:10.1074/jbc.M109.098004.

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[11]鄭君毅，蔡英，王霽翔，等.微小RNA-1在缺氧心肌細胞凋亡中的作用研究[J]．天津醫藥，2014，42(7):641-644.

（2013-10-17收稿 2014-03-27修回）

（本文編輯 魏杰）

Downregulation MicroRNA-1 Can Protect H2O2Injured Cardiomyocytes

ZHENG Junyi1,CAI Ying2,CONG Hongliang1,ZHOU Jin1
1 Department of Cardiology,Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300222，China；2 Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin Neurosurgery Institute，Tianjin Cerebrovascular and Neurodegeneration Key Laboratory CONG Hongliang,E-mail：hongliangcong@163.com

ObjectiveTo investigate the protective function and mechanism of microRNA-1(miR-1)downregulation in H2O2injured cardiomyocytes.MethodsThe experiment was divided into 4 groups:Blank group,Negative Control group(NC),H2O2group and H2O2+AS-miR-1 group.Cells in blank group were not underwent any treatment.Cells in NC group were transfected with random miRNA fragment.H2O2and H2O2+AS-miR-1 groups were defined as H2O2injured cardiomyocytes without or with transfected antisense miR-1 oligonucleotide（AS-miR-1）.Real time PCR was used to test miR-1 transcription level,and cell vitality and apoptosis were analyzed by MTT and flow cytometry.The target gene of miR-1 was predicted by bioinformatics,then its mRNA transcription and protein expression level of Bcl-2 were detected by real time PCR and western blot respectively.ResultsThere is no significant difference of all index between Blank group and NC group.H2O2can induce cardiomyocyte injury,increase miR-1 level and rise apoptosis rate,reduce cell vitality and decrease Bcl-2 expression level.Transfection of AS-miR-1 can decrease cell apoptosis,increase cell vitality and enhance Bcl-2 expression level.ConclusionDownregulation of microRNA-1 can protect cardiomyocytes that was injured by H2O2through increasing anti-apoptosis factor Bcl-2 expression.

microRNAs;myocytes,cardiac;apoptosis;transfection;oxidative stress;hydrogen peroxide;miR-1

R542.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.001

國家青年自然科學基金（81303091）

1天津市胸科醫院心內科（郵編300222）；2天津市環湖醫院,天津市神經外科研究所，天津市腦血管與神經變性重點實驗室

△通訊作者 E-mail：hongliangcong@163.com