GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因多態性與乳腺癌蒽環和（或）紫杉類藥物化療血液毒性關系的研究

劉新蘭 趙艷姣 黃 英 姜 敏

GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因多態性與乳腺癌蒽環和（或）紫杉類藥物化療血液毒性關系的研究

劉新蘭 趙艷姣 黃 英 姜 敏

目的 研究乳腺癌外周血中谷胱甘肽轉硫酶（GST）M1、GSTT1和GSTP1（rs1695）基因多態性與乳腺癌患者采用蒽環類和（或）紫杉類藥物化療發生血液毒性的關系。方法應用多重PCR技術（M-PCR）和高分辨熔解曲線技術（HRM）檢測3個基因在252例女性乳腺癌患者外周血中的基因多態性。結果采用紫杉類、蒽環聯合紫杉類藥物化療，攜帶GSTP1(rs1695)AG/GG的患者是發生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低的危險因素(OR=6.111,95％CI 1.526～24.469,P＜0.05和OR=9.257,95％CI 2.903～29.522,P＜0.01)，而GSTM1(+)與GSTM1(-)、GSTT1(+)與GSTT1(-)患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發生率差異均無統計學意義；采用蒽環類藥物化療，GSTM1(+)和GSTM1(-)、GSTT1(+)和GSTT1(-)、GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性發生率差異均無統計學意義(P＞0.05)。結論GSTP1(rs1695)基因多態性可作為預測乳腺癌患者采用紫杉類藥物化療發生中性粒細胞毒性的標志。

乳腺腫瘤；抗腫瘤聯合化療方案；谷胱甘肽轉移酶；多態現象，遺傳；聚合酶鏈反應；谷胱甘肽轉硫酶；化療血液毒性；高分辨熔解曲線技術

蒽環類和紫杉類藥物是乳腺癌化療的基石用藥，二者可顯著延長乳腺癌患者的生存期，具有良好的療效及優勢，但在應用時受到其不良反應的限制。且臨床中發現，即使腫瘤分期、病理類型及治療方案皆相同的患者，化療不良反應的程度也可能不同，差異的原因與單核苷酸多態性（SNP）有關。研究表明，谷胱甘肽轉硫酶（GST）M1、GSTT1和GSTP1 （rs1695）基因具有多態性，GSTM1和GSTT1缺失基因型（-）編碼無活性的酶；GSTP1第5外顯子上A313→G改變（SNP位點rs1695），使其編碼的酶的活性降低甚至消失，引起化療療效及毒性的差異[1-2]。本研究通過檢測252例乳腺癌患者3種酶的基因多態性，分析其與蒽環類和（或）紫杉類藥物化療血液毒性的關系，探討3個基因多態性作為預測乳腺癌患者發生血液毒性的可行性，以期達到個體化及安全有效用藥的目的。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月—2013年1月在寧夏醫科大學總醫院腫瘤醫院就診、均經病理形態學和免疫組織化學確診、病例資料完整的女性乳腺癌患者252例，年齡30～72歲，中位年齡48歲。按照2011年美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）指南進行臨床分期：Ⅰ期53例，Ⅱ期50例，Ⅲ期21例，Ⅳ期128例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和DNA提取 所有患者化療前抽取外周靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，全血基因組DNA抽提采用美國OMEGA公司的3392-01試劑盒。Nanodrop2000檢測樣本DNA濃度和純度，統一標定模板DNA濃度為25 mg/L，經電泳檢測，電泳條帶應＞10 kb且無明顯降解，分裝后置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計 采用GenBank已知序列設計引物，引物由上海生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences of glutathione s-transferase M1,T1 and P1(rs1695)表1 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因引物序列

1.2.3 多重PCR技術（M-PCR） 采用M-PCR技術檢測GSTM1和GSTT1基因多態性，β-Globin為內對照。M-PCR的反應總體系為50 μL，其中0.1 μmol/L的GSTM1、GSTT1和β-Globin上、下游引物各1 μL，PCR-master-mix 25μL，無菌雙蒸水（ddH2O）17 μL，DNA模板2 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性45 s、58℃退火45 s、72℃延伸45 s，共35次循環，最后72℃延伸7 min，結束反應。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓為5 V/cm，電泳35 min，后在美國Bio-Rad Gel Doc 200凝膠成像系統下觀察，攝像并記錄結果。經PCR擴增、電泳后，缺失基因型（-）不被擴增，電泳無條帶顯示。內對照β-Globin片段電泳表現為268 bp條帶，GSTM1（+）為215 bp，GSTT1（+）為480 bp。

1.2.4 高分辨熔解曲線技術（HRM） 采用定量PCR為基礎的HRM技術檢測GSTP1(rs1695)A313G位點的基因型。HRM反應總體系為10 μL，其中0.1 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，Eva熒光素0.5 μL，PCR-master-mix 5 μL，ddH2O 2 μL，DNA模板2 μL。HRM反應條件：（1）擴增階段。95℃預變性2 min，95℃變性10 s，61℃退火10 s，72℃延伸7 min，30個循環。（2）熔解曲線階段。數據采集從65℃開始，按照0.25℃/s的速度升溫，期間每隔0.04 s采集1次圖像，升溫至95℃結束反應。Roche 480軟件分析輸出實驗結果。根據HRM檢測的不同基因型隨機抽取10％的樣本送至南京金斯瑞生物技術有限公司進行基因測序，以驗證HRM技術檢測結果的準確性。

1.2.5 化療方案 所有患者均接受以蒽環類和（或）紫杉類藥物為基礎的化療方案，其中以蒽環類為主方案化療124例（AC/CAF，環磷酰胺+阿霉素/5-Fu方案）；以紫杉類為主方案化療58例（TX，紫杉醇+卡培他濱），以蒽環聯合紫杉類方案化療70例（T/DA，紫杉醇/多西紫杉醇+阿霉素）。阿霉素劑量為50～60 mg/m2靜脈注射，第1天；紫杉醇劑量為135～175 mg/m2或多西紫杉醇（D）60 mg/m2靜脈滴注，第1天；卡培他濱1 000 mg/m2口服第1～14天。

1.2.6 毒性判定 化療2個周期后，對252例患者進行化療血液學毒性判定，參照CTCAE（Common Terminology Criteria for Adverse Events）v3.0標準[3]，分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ度。

1.3 統計學方法 所有數據經SPSS 11.5統計軟件進行分析?；蛐头植疾捎肏ardy-Weinberg遺傳平衡檢驗；χ2檢驗及Fisher確切概率法分析不同基因型與乳腺癌患者化療發生血液毒性的關系；非條件Logistic回歸模型計算比值比（OR）和95％可信區間（CI）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌中GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態性分布 252例乳腺癌中，GSTM1和GSTT1基因均有非缺失型(+)和缺失型(-)2種分型，缺失基因型系基因發生片段缺失后，經PCR擴增電泳后無目的條帶產生；其中GSTM1(-)占57.1％(144/252)；GSTT1(-)占29.4％(74/252)。GSTP1(rs1695)基因有AA、AG和GG 3種分型，經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，證實本組患者GSTP1(rs1695)基因型分布符合遺傳平衡定律，具有群體代表性，見表2。GSTM1 和GSTT1基因分型電泳結果見圖1，GSTP1(rs1695)基因多態性分布圖及測序結果見參考文獻[4]中圖1、2。

2.2 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態性與乳腺癌患者接受不同方案化療血液毒性的關系

2.2.1 蒽環類藥物為主化療 124例患者中，GSTM1 （+）和GSTM1（-）、GSTT1（+）和GSTT1（-）、GSTP1AA 和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發生率差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

Tab.2 Genotype distribution and allele frequency of GSTP1(rs1695)表2 GSTP1(rs1695)基因型分布及等位基因頻率

Fig.1 GSTM1 and GSTT1 gene amplification products圖1 GSTM1和GSTT1基因擴增產物電泳結果圖

Tab.3 Association between GSTM1,GSTT1 and GSTP1 (rs1695)gene polymorphisms with hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Anthracycline-based chemotherapy表3 乳腺癌患者蒽環類藥物化療血液毒性與GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態性的關系 例

2.2.2 紫杉類藥物為主化療 58例患者中，發生0～Ⅱ度中性粒細胞減低毒性占31.03％（18/58），發生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低毒性占68.97％（40/58）。GSTP1AG/GG攜帶者Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低發生率高于GSTP1AA攜帶者（P＜0.01）。GSTM1（+）和GSTM1（-）、GSTT1（+）和GSTT1（-）患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發生率差異均無統計學意義；GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度白細胞減低、血紅蛋白減低及血小板減低的發生率差異均無統計學意義，見表4。

Tab.4 Association between 3 gene polymorphisms with hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Paclitaxel-based chemotherapy表4 乳腺癌患者紫杉類藥物化療血液毒性與GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態性的關系 例

分別以上述3個基因為自變量[GSTM1（+）=0，GSTM1（-）=1；GSTT1（+）=0，GSTT1（-）=1；GSTP1AA=0，GSTP1AG/GG=1]，上述化療中性粒細胞減低為因變量（0～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1），行非條件Logistic回歸分析，結果顯示采用紫杉類藥物化療患者攜帶GSTP1 AG/GG基因型是發生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低的危險因素，見表5。

Tab.5 Unconditional Logistic regression of 3 gene polymorphisms with neutropenia of breast cancer patients receiving Paclitaxel-based chemotherapy表5 3個基因多態性與乳腺癌患者接受紫杉類藥物化療血液毒性關系的非條件Logistic回歸分析

2.3 蒽環聯合紫杉類藥物化療 70例患者中發生0～Ⅱ度中性粒細胞減低毒性占45.7％（32/70），發生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低毒性占54.3％（38/70）。GSTP1AG/GG攜帶者Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低發生率高于GSTP1AA攜帶者（P＜0.01）。GSTM1（+）和GSTM1（-）、GSTT1（+）和GSTT1（-）患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發生率差異均無統計學意義；GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度白細胞減低、血紅蛋白減低及血小板減低的發生率差異無統計學意義，見表6。

Tab.6 Association between 3 gene polymorphisms with hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy表6 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態性與乳腺癌患者接受蒽環類聯合紫杉類方案化療血液毒性的關系 例

按結果2.2中相同的變量賦值方法行非條件Logistic回歸，結果顯示采用蒽環聯合紫杉類藥物化療患者攜帶GSTP1 AG/GG基因型是發生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低的危險因素，見表7。

Tab.7 Unconditional logistic regression of 3 gene polymorphisms with neutropenia of breast cancer patients receiving Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy表7 3個基因多態性與乳腺癌患者接受蒽環聯合紫杉類藥物化療血液毒性關系的非條件Logistic回歸分析

3 討論

3.1 GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因生物學功能和作用機制 蒽環類和（或）紫杉類藥物均經肝臟GST家族（GSTs）代謝活化，GSTs是人體內的Ⅱ相代謝酶，通過催化親電子物質與還原型谷胱甘肽結合發揮解毒效應[5]。GSTs催化阿霉素與還原型谷胱甘肽結合，增加其水溶性，從膽汁和尿液排出體外[5]；抗微管藥物通過GSTs與促細胞分裂原活化蛋白激酶（MAPK）之間的c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK1）通路相連接而產生應激反應和細胞凋亡[6]。GSTM1、GSTT1和GSTP1基因是GSTs家族重要組成成員，分別編碼GST-μ、GST-θ和GST-π同工酶。GSTM1(+)和GSTT1(+)基因型的個體可防御內外源性物質對細胞的損傷；而GSTM1(-)和GSTT1 (-)基因型編碼的酶無活性[1]，從而增加機體對腫瘤的易感性和化療藥物的損傷[7]。GSTP1第5外顯子上A313→G（Ile105→Val）改變（SNP位點rs1695），可導致其編碼的蛋白質的熱穩定性下降和特異性催化活性降低[2]。本研究GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因型分布頻率與文獻報道一致[8]。

3.2 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態性與乳腺癌患者化療的關系 多數研究顯示GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態性與以蒽環類和（或）紫杉類藥物化療療效[4，9]、毒性[10]及預后[11]密切相關。Yao等[10]采用基質輔助激光解吸電離（MALDITOF）的方法研究乳腺癌患者接受以環磷酰胺+吡柔比星/表柔比星+氟尿嘧啶（CAF/CEF）為主方案化療的結果顯示，與GSTP1AA基因型相比，至少含有1個GSTP1 G基因的患者易發生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞毒性（OR=0.63,95％CI 0.41～0.97）和白細胞毒性（OR= 0.59,95％CI 0.39～0.89）。本研究顯示：采用紫杉類方案化療、蒽環聯合紫杉類藥物化療，GSTP1(rs1695) AG/GG基因型患者Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低發生率高于GSTP1(rs1695)AA基因型。中性粒細胞減低為骨髓抑制的敏感指標，說明GSTP1(rs1695)基因多態性可預測乳腺癌患者采用紫杉類藥物發生骨髓抑制的可能性。GSTP1(rs1695)AA基因型可保護正常造血系統免受化療藥物的攻擊，GSTP1(rs1695)GG/AG基因型的患者，因解毒化療藥物的能力降低，導致有效血藥濃度增高，加之化療藥物對靶腫瘤的特異殺傷作用低下，在獲得高化療有效率的同時也對正常組織構成威脅，在聯合化療時其不良反應尤為明顯。因此根據基因型與體表面積給予合適的化療劑量是一個值得探索的方向。

綜上所述，GSTP1基因SNP可作為預測乳腺癌患者采用紫杉類藥物化療發生骨髓抑制的標志。因此，通過檢測外周血GSTP1(rs1695)基因多態性，在采用紫杉類藥物化療后24 h，給予攜帶GSTP1 (rs1695)GG/AG基因型患者注射粒細胞集落刺激因子可預防化療相關重度骨髓抑制的發生，保障患者如期完成化療。

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（2013-09-25收稿 2014-03-10修回）

（本文編輯 李鵬）

Correlation between Polymorphisms of GSTM1,GSTT1 and GSTP1(rs1695)on Hematologic Toxicities with Anthracycline/Paclitaxel-Based Chemotherapy in Breast Cancer

LIU Xinlan,ZHAO Yanjiao,HUANG Yin,JIANG Min
The General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004，China

ObjectiveTo examine the effects of genetic polymorphisms in GSTM1,GSTT1 and GSTP1(rs1695) genes on hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Anthracycline/Paclitaxel-based chemotherapy.MethodsMultiply PCR technique and High Resolution Melting method were used to examine these 3 genes polymorphsim in female breast cancers(n=252).ResultsThe GSTP1(rs1695)AG/GG genotype was a risk factor forⅢ-Ⅳdegree of neutrophil toxicity when patients

Paclitaxel-based chemotherapy and Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy (OR=6.111,95％CI 1.526-24.469,P＜0.05 and OR=9.257,95％CI 2.903-29.522,P＜0.01).There were no statistic difference onⅢ-Ⅳdegree hematologic toxicities rates between GSTM1(+)and GSTM1(-),GSTT1(+)and GSTT1(-)patients after they receiced Paclitaxel-based chemotherapy and Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy(P＞0.05);There was no statistic difference onⅢ-Ⅳdegree hematologic toxicities rates between GSTM1(+)and GSTM1(-),GSTT1(+)and GSTT1(-), GSTP1AA and GSTP1AG/GG patients after they receiced Anthracycline-based chemotherapy(P＞0.05).ConclusionThe genetic polymorphisms in GSTP1(rs1695)can be used as a gene marker for forecasting the chemotherapy,inducing neutropenia toxicities in breast cancer patients receiving Paclitaxel-based chemotherapy.

breast neoplasms;antineoplastic combined chemotherapy protocols；glutathione transferase;polymorphism，genetic;polymerase chain reaction;glutathione S-transferase;chemotherapy toxicities;high resolution melting

R737.9，R730.53

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.002

寧夏回族自治區銀川市應用研究開發計劃項目（2011029）

寧夏醫科大學總醫院（郵編750004）