SYBR Green實時定量端粒重復序列擴增法檢測端粒酶活性

麻文青 連福治 汪金泉 楊 磊,△

SYBR Green實時定量端粒重復序列擴增法檢測端粒酶活性

麻文青1連福治2汪金泉3楊 磊1,2△

目的 采用實時定量端粒重復序列擴增法（RQ-TRAP法）檢測不同細胞端粒酶活性。方法用RQTRAP和TRAP-ELISA兩種方法同時檢測12種細胞的端粒酶活性，并比較兩種方法的檢測結果。結果RQ-TRAP方法能準確特異地檢測系列稀釋的293T細胞蛋白提取液的端粒酶活性，靈敏度可達8個細胞，擴增效率為98.92％。陰性對照組則未檢測到端粒酶活性。RQ-TRAP方法測得12個細胞系中端粒酶的活性與TRAP-ELISA方法結果有較強相關性（r2=0.762 5）。兩種方法檢測腫瘤細胞端粒酶活性均高于正常細胞。結論RQ-TRAP方法檢測端粒酶可行，比TRAP-ELISA方法成本低、時間短，且支持高通量，是一種新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。

端粒；基因擴增；酶聯免疫吸附測定；端粒酶活性；端粒重復序列擴增；TRAP-ELISA

端粒酶是一種核糖核蛋白復合體[1]。在絕大多數永生化細胞系和腫瘤細胞中端粒酶活性較高[2]。因此，端粒酶可能為腫瘤的診斷和治療提供新的方向[3]。目前端粒酶活性的檢測主要采用TRAP-ELISA 法[4]。但是該法存在檢測時間長、成本相對較高等缺點。近年來，有研究將定量PCR與TRAP法結合起來，采用熒光染料SYBR Green，建立了SYBR Green實時定量端粒重復序列擴增法（RQ-TRAP法）[5]。本實驗采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA法檢測不同細胞端粒酶活性，旨在證實RQ-TRAP法的優勢。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 細胞由本室保存及其他實驗室惠贈，RPMI-1640培養基、DMEM培養基和新生胎牛血清均為Hy-Clone產品，TRAP-ELISA端粒酶檢測試劑盒TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS購于Roche公司；RQ-TRAP引物參照文獻序列如下：TS 5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，ACX 5′-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。SYBR Green實時定量試劑盒購于TaKaRa公司，所用定量PCR儀為Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）。

1.2 細胞培養 所選細胞包括人腎上皮細胞系293T細胞、人肝癌細胞系HepG2細胞、人乳腺癌細胞系MCF7細胞、人宮頸癌細胞系HeLa細胞、人腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC-12細胞、人結腸腺癌細胞系RKO細胞、人急性T細胞白血病細胞系Jurkat細胞、人淋巴瘤細胞系U937細胞和人卡巴式肉瘤相關皰癥病毒感染細胞系BCBL-1細胞，以及人肝細胞系L-02細胞、人視網膜色素上皮細胞系D407細胞和鼠成纖維細胞系L929細胞。Jurkat細胞、U937細胞、BCBL-1細胞培養在含10％新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素溶液的RPMI-1640培養基中，其他細胞均常規培養在含10％新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中，所有細胞均在37℃、5％CO2和95％相對濕度條件下孵育培養。每2～3 d傳代1次。

1.3 細胞蛋白提取液的制備 RQ-TRAP用細胞蛋白提取液按Kim法制備：收集細胞，PBS沖洗1次，10 000×g4℃離心1 min收集細胞，沉淀細胞用預冷的洗液[10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸氫氧化鉀（Hepes-KOH，pH 7.5），1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）]重懸，再離心，重懸1×104～1×106個細胞在20 μL預冷的細胞裂解液里[10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA），0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），5 mmol/L β-巰基乙醇，0.5％3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），10％甘油]。冰上孵育30 min，16 000×g4℃離心20 min，收集上清，迅速冷凍，-80℃保存。TRAP-ELISA用細胞蛋白提取液制備方法按照TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS（Roche Molecular Biochemicals）試劑盒說明制備。取5 μL的細胞提取液加入2 μL DNase-free RNase（0.5 g/L），37℃孵育20 min以滅活端粒酶，作為實驗陰性對照。

1.4 RQ-TRAP檢測端粒酶活性 依照參考文獻[5]檢測RQTRAP端粒酶活性，定量PCR采用Takara SYBR PremixEx TaqTM實時定量試劑盒（Takara DRR041A）。取5倍系列稀釋的端粒酶陽性的293T細胞提取液（1 000、200、40、8個細胞），以及2種陰性對照樣本分別作為PCR模板同時進行定量PCR反應。2種陰性對照按照如下方法設立。（1）以裂解液替代細胞提取液，用以監測PCR過程是否有污染。（2）RNase處理后，端粒酶RNA模板被降解，作為檢測樣本的自身對照。定量PCR反應體系（20μL）為：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL，PCR Forward Prime TS（10μmol/L）0.8μL，PCR Reverse Prime ACX（10μmol/L）0.4μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模板（細胞提取液）1μL。PCR反應程序包括：（1）端粒延長，25℃孵育20 min。（2）端粒酶滅活，95℃5 min。（3）擴增循環，95℃變性5 s，60℃退火/延伸31 s，共40個循環。運用ABI7300軟件采集和分析數據，通過軟件可以計算出標準品和所有樣品達到熒光閾值的循環數（Ct），以細胞數為橫坐標軸，Ct值為縱坐標軸做標準曲線。取1 000個細胞制備的細胞提取液進行樣品檢測，評價方法為每個樣品相對于同樣細胞數293T細胞的端粒酶活性的比值。每個樣本重復3次。

1.5 TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性 參照Roche公司的TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS試劑盒及文獻操作說明進行操作。收集培養的活力良好的細胞并計數2×105個細胞，冷PBS洗2次，加裂解液200μL，冰上裂解30 min， 16 000×g低溫離心20 min，取上清3μL加入TRAP反應液并加無核酸酶的水補足50μL進行PCR擴增，平行對照組于檢測前經RNase處理。反應條件為：引物延長25℃30 min；端粒酶滅活94℃5 min；擴增條件：變性94℃30 s；退火50℃30 s；延伸72℃90 s循環30次。取2.5μL擴增產物，每個樣品加10μL變性液，室溫反應10 min，加雜交液100μL，充分混勻，將上述混合液體加入到鏈霉親和素包被的微量反應板中，300 r/min 37℃孵育2 h；棄去雜交液,輕輕地用沖洗緩沖液清洗3次，向每孔中加入100μL抗地高辛過氧化物酶，300 r/min搖床室溫30 min；棄去液體，用沖洗緩沖液清洗5次，加100μL TMB底物液，室溫下觀察顏色反應。端粒酶陽性時，液體由無色透明逐漸變藍，加入終止液，顏色由藍變黃。加入終止液后30 min，在酶標儀上測450 nm處吸光度值，參考波長為690 nm。每個樣本重復3次。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示；RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法的關聯性用線性回歸模型分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RQ-TRAP標準曲線 4個濃度的293T細胞提取液均檢測到擴增產物，而2種陰性對照均沒有檢測到擴增產物。隨著模板濃度的降低，Ct值隨著增大，但在8個細胞的裂解液中也能有效地檢測出擴增產物，見圖1A。PCR產物的熔解曲線顯示為單峰，沒有引物二聚體的形成，見圖1B。PCR結果做標準曲線顯示擴增斜率為-3.34，決定系數（R2）達到0.997，擴增效率為98.92％。

Fig.1 The standard curve of telomerase activity measured by RQ-TRAP圖1 RQ-TRAP測定端粒酶活性標準曲線

2.2 RQ-TRAP與TRAP-ELISA檢測端粒酶活性結果比較 兩種方法測得12種細胞的相對端粒酶活性，見表1。兩種方法測得的端粒酶活性存在相關性（r2=0.762 5，P＜0.05）。端粒酶活性結果還顯示，兩種方法測得的腫瘤細胞端粒酶活性均高于正常細胞。

Tab.1 Comparison of telomerase activity measured by RQ-TRAP and TRAP-ELISA表1 RQ-TRAP和TRAP-ELISA測得相對端粒酶活性比較

3 討論

本實驗是采用端粒重復序列擴增和SYBR Green熒光定量PCR相結合的SYBR Green實時定量端粒重復序列擴增（RQ-TRAP）方法檢測端粒酶活性，以縮短操作時間、減少繁瑣的擴增后操作步驟（如聚丙烯酰胺凝膠電泳或ELISA等）。實驗采用Kim等[6]文獻報道的TS和ACX引物，無引物二聚體的形成。同時RQ-TRAP方法能準確特異地檢測12種細胞的端粒酶活性，且在8個細胞濃度時仍能有效地檢測，顯示該方法具有較高靈敏度。同時，擴增效率達98.92％，可高效率地檢測端粒酶活性。

目前，TRAP-ELISA檢測端粒酶活性方法較為常用，它具有靈敏、特異及可定量人端粒酶活性等優點，但是仍存在擴增后處理時間較長，成本相對較高等問題。近年來，有研究將定量PCR與TRAP法結合起來，采用熒光染料SYBR Green建立了一種新的端粒酶活性檢測方法，即RQ-TRAP法。Wege等[5]研究認為TRAP-ELISA與RQ-TRAP有相關性，且RQ-TRAP有耗時短、線性結果可靠等優點。另外Hou等[7]的研究也表明RQ-TRAP方法是一種新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。本實驗將研究樣本增加到12個細胞系，包括腫瘤細胞系和正常細胞系。利用RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法同時檢測端粒酶活性，并對兩種方法進行相關性分析，實驗結果顯示：9個腫瘤細胞系的相對端粒酶活性均高于3個正常細胞系，這一結果與普遍認為的腫瘤細胞有較高的端粒酶活性相一致。用RQ-TRAP方法測得12個細胞系中端粒酶的活性與TRAP-ELISA結果相關性為r2=0.762 5，表明RQ-TRAP方法可以作為一種檢測端粒酶活性的方法，與TRAP-ELISA方法比較，它消除了擴增后復雜的ELISA過程，縮減了時間和繁瑣的操作步驟，降低了成本，可以高通量進行,提高了檢測效率，是一種可靠、能快速定量端粒酶活性的方法。

端粒酶在腫瘤組織中的檢出率為85％～95％，而在非腫瘤組織和各種正常組織中其檢出率為4％～6％[8]。本研究中3種正常細胞系的端粒酶活性均低于其他9個腫瘤細胞系，此結果符合目前研究成果，所以RQ-TRAP法是一種可靠地檢測端粒酶活性的方法。

[1]Qi A,Zhou H,Zhou Z,et al.Telomerase activity increased and telomere length shortened in peripheral blood cells from patients with immune thrombocytopenia[J].J Clin Immunol,2013,33(3):577-585. doi:10.1007/s10875-012-9848-z.

[2]Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer[J].Eur J Cancer,1997,33(5):787-791.

[3]Holysz H,Lipinska N,Paszel-Jaworska A,et al.Telomerase as a useful target in cancer fighting-the breast cancer case[J].Tumour Biol,2013,34(3):1371-1380.doi:10.1007/s13277-013-0757-4.

[4]Huang KZ,Nie DN,Yin SM,et al.Cyclin D1,hTERT expression and telomerase activity in HL-60 and HL-60A cell lines and their significance[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2011,19(4): 911-915.

[5]Wege H,Chui MS,Le HT,et al.SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity[J].Nucleic Acids Res,2003,31(2):E3-3.

[6]Kim NW,Wu F.Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP)[J].Nucleic Acids Res,1997,25(13):2595-2597.

[7]Hou M,Xu D,Bjorkholm M,et al.Real-time quantitative telomeric repeat amplification protocol assay for the detection of telomerase activity[J].Clin Chem,2001,47(3):519-524.

[8]Gunes C,Rudolph KL.The role of telomeres in stem cells and cancer [J].Cell,2013,152(3):390-393.doi:10.1016/j.cell.2013.01.010.

（2014-02-21收稿 2014-03-31修回）

（本文編輯 魏杰）

Combined SYBR Green Real-Time with Telomeric Repeat Amplification Protocol(RQ-TRAP) to Detect Telomerase Activity

MA Wenqing1,LIAN Fuzhi2,WANG Jinquan3,YANG Lei1，2
1 Medical College，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2 Medical College，Hangzhou University;3 College of Life and Environmental Sciences,Shihezi University YANG Lei,E-mail：yanglei62@hznu.edu.cn

ObjectiveTo establish methodology to detect telomerase activity based on real-time quantitative PCR technique combined with telomeric repeat amplification protocol(TRAP).MethodsRQ-TRAP system was developed by combining real-time quantitative PCR technique with conventional TRAP method.Telomerase activity was assessed and compared by RQ-TRAP assay and TRAP connected with enzyme-linked immunosorbent assay(TRAP-ELISA)respectively in 12 kinds of cells.ResultsThe RQ-TRAP method was both accurate and specified in measuring telomerase activity in a series dilution of protein extracts from 293T cells.The sensitivity of this method was 8 cells and the amplification efficiency was 98.92％.Telomerase activity was not detected in negative control group.Statistical analysis revealed a strong correlation between the two assays(r2=0.762 5).ConclusionThe feasibility of RQ-TRAP was proved in this article.Compared with TRAP-ELISA,RQ-TRAP has many advantages.Apart from sample extraction and real-time PCR cycling,no other extra time-consuming steps are needed for telomerase quantification；RQ-TRAP is less costly and more rapid and reliable than TRAP-ELISA for quantification of telomerase activity and it also support high throughput.

telomere;gene amplification;enzyme-linked immunosorbent assay;telomerase activity；telomeric repeat amplification protocol；TRAP-ELISA

R34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.003

國家重大科學研究計劃項目（2012CB911200）

1石河子大學醫學院（郵編832000）；2杭州師范大學醫學院；3石河子大學生命科學學院

△通訊作者 E-mail：yanglei62@hznu.edu.cn