基于慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建重組JSRV-NM假病毒

龔淑敏 李光明 吳志敏 董莉真 程 彬 張 斌 朱 澤△

基于慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建重組JSRV-NM假病毒

龔淑敏1李光明2吳志敏2董莉真2程 彬2張 斌2朱 澤2△

目的 采用慢病毒質(zhì)粒結(jié)構(gòu)重組JSRV-NM假病毒，克服JSRV-NM病毒只能通過綿羊支氣管穿刺接種擴(kuò)增，不能通過體外細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的問題。方法采用慢病毒高效包裝系統(tǒng)pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIV-eGFP，以JSRV-NM病毒的env包膜質(zhì)粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜質(zhì)粒pMD.G，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，復(fù)制、包裝并產(chǎn)出重組的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR檢測WPRE表達(dá)來測定假病毒的滴度，用接種24孔板的293T細(xì)胞檢測假病毒感染力。結(jié)果成功重組了基于慢病毒質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的JSRV-NM假病毒，可超速離心濃縮成高滴度（1×108TU/mL）的病毒，Lv-JSRV-NM包膜與Lv-VSV-G包膜按感染復(fù)數(shù)（MOI）=3的比例感染Hela細(xì)胞具有相同的感染能力。結(jié)論基于慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建的JSRV-NM假病毒，能夠在293T細(xì)胞中復(fù)制和擴(kuò)增，產(chǎn)出的假病毒具有穩(wěn)定性、感染力和安全性，符合二級(jí)生物實(shí)驗(yàn)室安全的要求。

JSRV-NM病毒；假病毒；慢病毒載體；env基因；病毒包裝

加亞嘉西科逆轉(zhuǎn)錄病毒（Jaagsiekte retrovirus，JSRV）屬于RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，經(jīng)呼吸道傳播，主要引起羊肺腺瘤（sheep pulmonary adenomatosis，SPA）。JSRV最早于1976年由英國愛丁堡大學(xué)的Sharp教授發(fā)現(xiàn)并分離鑒定，其包膜env基因是原癌基因，具有肺腺癌致瘤性[1-2]，前期有研究分離純化了我國內(nèi)蒙古肺腺瘤綿羊中存在的JSRV[3]，并命名為加亞嘉西科逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)蒙古病毒株（JSRV-NM）[4]。JSRV-NM基因組RNA為線性+ssRNA，全長7 642 bp，其基因組RNA編碼區(qū)內(nèi)具有相互重疊的gag、pro、pol、env基因的典型結(jié)構(gòu)[5]。慢病毒載體系統(tǒng)是以人類免疫缺陷病毒（HIV）-1為骨架，由3個(gè)編碼病毒顆粒gag、pol、env結(jié)構(gòu)的包裝質(zhì)粒pMD.G、pCMVHIV△8.2和pHIV-eGFP組成。包膜質(zhì)粒pMD.G基因表達(dá)水皰性口炎病毒的包膜糖蛋白VSV-G[6]；包裝質(zhì)粒pCMV-HIV△8.2用于表達(dá)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白以及病毒復(fù)制所需的酶等[7]。由于JSRV-NM病毒不能通過常規(guī)培養(yǎng)方法在體外復(fù)制和擴(kuò)增，本研究在慢病毒載體系統(tǒng)基礎(chǔ)上，構(gòu)建以JSRV-NM病毒env基因?yàn)榘べ|(zhì)粒，替代包膜VSV-G的質(zhì)粒pMD.G，重組構(gòu)建“JSRV-NM假病毒”，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和細(xì)胞 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司；HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸購自Sigma公司；SOB培養(yǎng)液、Lipofectamine 2000和Trizol購自Invitrogen公司；real-time PCR和RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司；質(zhì)粒去內(nèi)毒素大提試劑盒購自QIAGEN公司。其他試劑均為常用國產(chǎn)分析純級(jí)化學(xué)試劑。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌為DH5α菌株。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胚腎細(xì)胞系293T細(xì)胞、Hela細(xì)胞用含10％胎牛血清和100 g/L鏈霉素及100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。其培養(yǎng)均在37℃、5％CO2條件下進(jìn)行。

1.3 慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng) 慢病毒載體系統(tǒng)由pMD.G、pCMVHIV△8.2和pHIV-eGFP質(zhì)粒組成(法國國家醫(yī)學(xué)與健康研究院楊光華博士惠贈(zèng))。JSRV的env包膜質(zhì)粒pCMV3JS21GP（英國格拉斯哥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院Massimo Palmarini教授惠贈(zèng)）。JSRV-NM的env包膜質(zhì)粒pCMVJSRV-NM由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。主要是JSRV-NM的env序列由PCR法擴(kuò)增，插入pCI-neo載體，其啟動(dòng)子為人巨細(xì)胞病毒（CMV）。

1.4 質(zhì)粒的純化 將pHIV-eGFP、pCMV-HIV△8.2、pMD.G、pCMV3JS21GP、pCMVJSRV-NM等質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到高效感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，涂板后37℃培養(yǎng)12～16 h。挑單個(gè)菌落于含3～5 mL SOB培養(yǎng)液的試管中震蕩培養(yǎng)8 h，然后取200μL菌液于含200 mLSOB培養(yǎng)液的錐形瓶中震蕩培養(yǎng)12～16 h，待光密度（OD）600值達(dá)到0.6～1.0時(shí)，按照QIAGEN去內(nèi)毒素試劑盒步驟純化質(zhì)粒。

1.5 慢病毒載體的包裝 用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以密度0.5×106/mL接種于直徑為15 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃，5％CO2培養(yǎng)，待密度達(dá)60％～70％時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含抗生素的培養(yǎng)液。包裝DNA溶液分別為JSRV-NM包膜質(zhì)粒pCMVJSRV-NM（12μg），JSRV-21包膜質(zhì)粒pCMV3JS21GP（10μg），VSV-G包膜質(zhì)粒pMD.G（7μg），質(zhì)粒pCMV-HIV△8.2（8μg），pHIV-eGFP（10 μg）。將DNA溶液與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000混合并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)液，加PBS液漂洗，然后加入含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)液15 mL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集293T細(xì)胞上清液。4℃，4 000×g離心10 min，以0.45 μm濾器過濾后置于40 mL超速離心管中；4℃，25 000 r/min離心20 min；而后以冰PBS液重懸病毒沉淀，于4℃溶解過夜即得到病毒液Lv-JSRV-NM、Lv-JSRV-21。同法獲得陽性對(duì)照和陰性對(duì)照病毒液Lv-VSV-G、Lv-Negative。以每管10 μL分裝病毒液置于-80℃冰箱中保存。

1.6 real-time PCR測定病毒滴度 用real-time PCR檢測整合到Hela細(xì)胞基因組中的慢病毒W(wǎng)PRE序列來測定成功感染進(jìn)細(xì)胞的病毒滴度(單位TU/mL)，重復(fù)3次。接種Hela細(xì)胞于24孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，將稀釋病毒液感染Hela細(xì)胞，12 h后換液。感染72 h后，提取Hela細(xì)胞基因組DNA，PCR引物為：正義5′-CCGTTTCAGGCAACGTG-3′；反義5′-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3′；探針FAMTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTAMRA。real-time PCR反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃15 min；95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。按以下公式計(jì)算：病毒滴度＝5×104（Hela細(xì)胞數(shù)）×每個(gè)細(xì)胞的WPRE序列拷貝數(shù)/孔中加入病毒原液的體積(mL)，具體方法見文獻(xiàn)[8]。

1.7 重組JSRV-NM慢病毒的感染力檢測 將上述1.6測定濃度的Lv-JSRV-NM及Lv-VSV-G分別按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=3的比例感染Hela細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行real-time PCR檢測整合到Hela細(xì)胞基因組中的慢病毒W(wǎng)PRE序列，比較兩種包膜感染力。Hela細(xì)胞以濃度2× 105個(gè)/mL接種于24孔板中，每孔加500μL含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。吸去原培養(yǎng)液，加504μL含2％胎牛血清和病毒（4μL病毒液，MOI=3）的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，吸掉該培養(yǎng)液，再加500μL含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后，行real-time PCR檢測基因表達(dá)情況，方法詳見文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果

2.1 高質(zhì)量去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化 采用QIAGEN無內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒，獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒pHIV-eGFP(450 mg/L)、pCMV-HIV△8.2(400 mg/L)、pMD.G (400mg/L)、pCMVJSRV-NM（350mg/L）、pCMV3JS21GP （380mg/L）。

2.2 假病毒的包裝 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察到293T細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光，證實(shí)了eGFP基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞中熒光強(qiáng)度較轉(zhuǎn)染24 h時(shí)有所增強(qiáng)，由此慢病毒載體由293T細(xì)胞包裝產(chǎn)生。包裝的假病毒中含有報(bào)告基因eGFP，成功重組包裝的病毒可以看到綠色熒光，見圖1、2。外層用JSRV-NM病毒包膜代替了VSV病毒的包膜。

2.3 假病毒的滴度測定 Lv-JSRV-NM的滴度為1.0×108TU/mL，Lv-VSV-G為1.2×108TU/mL，Lv-JS-RV-21為1.5×108TU/mL、Lv-Negative為1.6×108TU/mL。

2.4 感染力 Lv-JSRV-NM的感染率為86.7％，Lv-VSV-G為82.9％。

Fig.1 The green fluorescence are Lv-VSV-G(×200)圖1 綠色熒光為Lv-VSV-G(×200)

Fig.2 The green fluorescence are Lv-JSRV-NM(×200)圖2 綠色熒光為Lv-JSRV-NM(×200)

3 討論

本研究在以往研究JSRV-NM病毒[5]和構(gòu)建慢病毒的基礎(chǔ)上[8]，構(gòu)建了以JSRV-NM病毒的env包膜質(zhì)粒替代VSV病毒的糖蛋白G包膜質(zhì)粒，通過熒光檢測成功重組了新的基于慢病毒質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的“JSRV-NM假病毒”。real-time PCR檢測顯示Lv-JSRV-NM包膜與Lv-VSV-G包膜具有一樣的功能及相同的感染能力。這不僅解決了JSRV-NM病毒不能在體外細(xì)胞復(fù)制和擴(kuò)增的問題，且能更好地解決控制病毒的擴(kuò)增數(shù)量、感染力和安全性問題，為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

采用基于慢病毒質(zhì)粒結(jié)構(gòu)重組的JSRV-NM假病毒具有更高的安全性，主要是因?yàn)楣P者采用的慢病毒載體是一個(gè)將載體3′端長末端重復(fù)序列中的U3區(qū)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列去除的自身失活（self-inactivating，SIN）的載體[9]，這種結(jié)構(gòu)組成能大大降低假病毒感染細(xì)胞后產(chǎn)生可復(fù)制的子代病毒的可能性。故JSRV-NM假病毒只具有一次感染能力，感染細(xì)胞模型后就不具有復(fù)制子代病毒的能力，同樣也沒有發(fā)現(xiàn)有基因突變和擴(kuò)增出子代病毒及缺陷病毒等，故稱之為“假病毒”，具有很高的安全性，符合二級(jí)生物實(shí)驗(yàn)室安全的要求。JSRV-NM包膜賦予重組JSRV-NM假病毒顆粒高度的穩(wěn)定性，JSRV-NM 的env包膜與VSV-G包膜一樣使病毒顆粒的穩(wěn)定性增加，能夠通過超速離心被濃縮成高滴度病毒，達(dá)到1×108TU/mL的高滴度。筆者也與Massimo Palmarini教授的JSRV21病毒包膜進(jìn)行了比較[10]，發(fā)現(xiàn)JSRV-NM假病毒與其一樣有很好的感染能力。近來研究發(fā)現(xiàn)JSRV假病毒包膜侵入宿主細(xì)胞時(shí)是pH依賴型進(jìn)行細(xì)胞膜融合[11]，為進(jìn)一步研究提供很好的方向。

綜上，基于慢病毒質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的高效包裝系統(tǒng)，本研究成功構(gòu)建了JSRV-NM假病毒，具有更高的安全性、穩(wěn)定性、感染能力，解決了JSRV-NM的體外復(fù)制和擴(kuò)增問題，為今后進(jìn)一步深入研究JSRV-NM的env包膜引起的跨種屬感染，及env包膜致瘤性引起的肺腺癌的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（2014-01-10收稿 2014-03-20修回）

（本文編輯 閆娟）

Construction of JSRV-NM Pseudovirions by High Efficiency Packaging System of the Lentivirus

GONG Shumin1，LI Guangming2，WU Zhimin2，DONG Lizhen2，CHENG Bin2，ZHANG Bin2，ZHU Ze2
1 The Fourth Hospital of Tianjin,Tianjin 300222,China;2 Department of Medical Microbiology,Tianjin Medical University ZHU Ze,E-mail:zhuze_2006@126.com

ObjectiveTo overcome the fact that SRV-NM virus can only multiple and amplify through partially purified jaagsiekte retrovirus inoculated intratracheally in sheep but it cannot be augmented using in vitro cell culture,we constructed JSRV-NM pseudovirions based on high efficiency packing system of lentivirus.MethodsLentivirus of three high efficiency packing plasmids system pMD.G,pCMV-HIV 8.2 and pHIV-eGFP was developed,and JSRV-NM-env coated plasmid pCMVJSRV-NM was used to substitute VSV-G virus coated plasmid pMD.G then co-transfected into 293T cells to replicate,package and produce restructured JSRV-NM pseudovirions.Gene expression of pseudovirion was determined through WPRE using real time PCR;Virus infectivity was detected through inoculating JSRV-NM pseudovirions into 24 pore plates.ResultsWe construct JSRV-NM pseudovirions successfully based on the lentivirus system.JSRV-NM pseudovirions can also be concentrated to higher titer(108TU/mL detected by real time PCR by ultracentrifugation without significant loss of activity.JSRV-NM and VSV-G pseudovirions infected on Hela cells(both MOI=3)respectively and no obvious difference were shown on their infection efficiency detected by real time PCR.ConclusionBased on lentivirus system, JSRV-NM pseudovirions can be multipled and amplified in 293T cell culture in vitro.JSRV-NM pseudovirions is stable without loss its infection activity and the requirements of biological laboratory safety II was also met.JSRV-NM pseudovirions will provide a useful tool for further study of JSRV-NM–env infection across species or its induction of lung adenocarcinoma.

JSRV-NM viruses；pseudovirions；lentivirus vector；env gene；virus packageing

Q939.47

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.004

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30772483)，天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(08JCZDJC23400)

1天津市第四醫(yī)院（郵編300222）;2天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室

△通訊作者 E-mail:zhuze_2006@126.com