人源性防御素HD-5的原核表達及抗真菌作用的初步研究

張萍萍 尹利榮△ 王 芳 孫 蓓 霍 彥

人源性防御素HD-5的原核表達及抗真菌作用的初步研究

張萍萍1尹利榮1△王 芳1孫 蓓2霍 彥3

目的 構建pQE-30Xa/HD-5原核表達載體，純化重組蛋白并進行抗真菌活性的初步鑒定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5為模板，聚合酶鏈反應（PCR）擴增編碼HD-5成熟肽的基因。構建pQE-30Xa/HD-5重組表達載體，并對重組質粒進行酶切、基因序列分析。將鑒定正確的質粒轉化入大腸桿菌M15后進行異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，對表達產物進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定。通過鎳柱親和層析純化蛋白并進行蛋白復性，蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定純化產物。以KB紙片法初步驗證純化獲得的重組蛋白對白色假絲酵母菌的抑菌活性。結果成功克隆了HD-5基因并構建了重組質粒pQE-30Xa/HD-5。重組質粒在大腸桿菌M15中誘導表達出HD-5融合蛋白；Western blot分析結果顯示純化后的融合蛋白與目的蛋白相符；KB紙片法證實純化后的融合蛋白對白色假絲酵母菌具有一定的抑菌活性。結論成功構建HD-5原核表達載體，經誘導表達后純化獲得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。

防御素類；重組融合蛋白質類；大腸桿菌；防御素-5；原核表達；親和層析；抗真菌活性

近年來，隨著廣譜抗菌藥物、各類激素等的廣泛使用，外陰陰道假絲酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）的發病率及復發率逐年升高，嚴重影響女性的身心健康。防御素因其相對分子質量小、對熱穩定、抗微生物范圍廣、不易產生耐藥性等明顯優于傳統抗生素的特點，成為抗生素替代的首選。防御素HD-5(human alpha-defensin 5)在女性生殖道上皮包括陰道、宮頸及輸卵管的上皮細胞均有表達與分泌。其與生殖道的感染性疾病密切相關也得到了證實[1]。但HD-5的來源少，提取困難，成為HD-5進一步研究及應用的瓶頸。近年來，國內外學者雖通過真核表達體系獲得HD-5蛋白，但仍存在蛋白提純困難等問題。本研究通過原核表達體系對HD-5進行融合表達與純化，并對融合蛋白的抗真菌活性進行初步鑒定，為獲取HD-5活性蛋白提供實驗基礎，為HD-5的進一步研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株 pQE-30Xa質粒、大腸桿菌M15菌株(E.coli M15)均為天津醫科大學內分泌研究所保存。pcDNA3.1(+)/HD-5為天津醫科大學內分泌研究所構建并經DNA序列分析正確。標準白色假絲酵母菌株ATCC-90028由北京中原公司從ATCC購進。

1.1.2 主要試劑 KOD-Plus高保真DNA聚合酶、限制性內切酶Kpn I和HindⅢ、T4 DNA連接酶、DNA Marker DL2000 Plus購自TaKaRa公司,小鼠抗His標簽抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠抗體購自中杉金橋生物公司。凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）、質粒小量提取試劑盒（Plasmid Mini Kit）購自OMEGA公司,鎳離子金屬螯合親和層析介質(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)親和層析蛋白純化柱料購自GeneScript公司；一步法細菌活性蛋白提取試劑盒購自上海生工生物有限公司。其余均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 編碼HD-5成熟肽的基因克隆 根據GenBank上編碼HD-5成熟肽的基因（NM_021010.1），采用Gene runner軟件設計合成上下游引物，兩端分別加入了Kpn I和HindⅢ兩個酶切識別序列。陰影部分為酶切位點，引物由北京奧科鼎盛生物公司合成。上游引物（p1）：5′-CGGGGTACCATGAGGACCATCGCC-3′；下游引物（p2）：5′-CCCAAGCTTGCGACAGCAGAGTCT-3′。以p1、p2為引物，pcDNA3.1(+)/HD-5為模板，進行PCR擴增。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環，72℃10 min終止反應。擴增結束后以1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

1.2.2 重組表達載體pQE-30Xa/HD-5的構建及鑒定 將質粒pQE-30Xa與HD-5 PCR產物分別用Kpn I和HindⅢ進行雙酶切后以T4 DNA連接酶于37℃連接30 min。將連接產物轉化E.coli M15，挑取氨芐青霉素(Amp)篩選的陽性克隆進行酶切鑒定及測序分析。

1.2.3 融合蛋白fHD-5的誘導表達及鑒定 將構建正確的pQE-30Xa/HD-5質粒再次轉化入E.coli M15感受態細胞中，挑取陽性單菌落至加入終濃度為1 g/L的Amp+的液態培養基中，過夜培養后1∶100轉接，37℃、250 r/min培養至OD600約0.5，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導培養6 h，收集菌體。通過一步法細菌活性蛋白提取試劑盒回收上清液及沉淀，進行15％SDS-PAGE電泳。以含空白pQE-30Xa質粒的E.coli M15宿主菌和未誘導的含pQE-30Xa/HD-5宿主菌為對照。

1.2.4 融合蛋白fHD-5的純化、復性及Western blot鑒定 采用Ni-NTA親和層析進行融合蛋白的純化。將包涵體儲備液溶于適量溶解緩沖液，去除雜質加入平衡后的層析柱中，沖洗液漂洗后，對融合蛋白進行柱上復性，復性緩沖液尿素起始濃度為6 mol/L，終止濃度為0 mol/L。最后以洗脫液進行線性洗脫，洗脫液中咪唑起始濃度為20 nmol/L，終止濃度為500 nmol/L。所有步驟均在?KTAprime蛋白層析純化系統上進行。對收集液行15％SDS-PAGE檢測分析。純化蛋白行15％SDS-PAGE電泳后，濕法轉至醋酸纖維素膜，封閉2 h，加入小鼠抗His標簽抗體，于4℃搖床過夜，洗膜，加入HRP標記的山羊抗小鼠抗體，于37℃孵育2 h，洗膜后ECL法顯色。

1.2.5 融合蛋白fHD-5抗真菌活性的檢測 采用KB紙片擴散法測定純化后的融合蛋白fHD-5的抗真菌活性。制備對數生長期的白色假絲酵母菌菌液（孢子含量105CFU/mL）。取100 μL均勻涂布于沙氏平板上。取直徑1 cm的無菌濾紙片浸泡于fHD-5溶液中，制備KB紙片。將浸泡過fHD-5溶液的濾紙片平鋪于涂菌的培養基上，37℃培養24 h。以浸泡PBS緩沖液的濾紙片為陰性對照組。

2 結果

2.1 編碼HD-5成熟肽的基因克隆 PCR擴增出清晰目的條帶，長度約250 bp與預期的人HD-5基因大小一致，見圖1。

Fig.1 Recombinant plasmid confirmed by PCR圖1 表達載體PCR電泳鑒定

2.2 pQE-30Xa/HD-5重組表達質粒的構建 重組質粒經限制性內切酶KpnⅠ、HindⅢ雙酶切后，獲得長度約3 000 bp、250 bp的2條片段，與預期相符，見圖1。DNA序列分析結果證實pQE-30Xa載體中插入大小為243 bp的基因片段與HD-5基因序列一致。

2.3 融合蛋白fHD-5的誘導表達及鑒定 含重組質粒pQE-30Xa/HD-5質粒的轉化菌在37℃誘導表達6 h后，其沉淀在11 ku處出現一明顯的深染條帶。空載體誘導表達后和重組未誘導菌在11 ku處無明顯條帶出現，見圖2。初步證實，誘導后的重組蛋白主要以包涵體形式表達。

Fig.2 HD-5 expression was confirmed by SDS-PAGE圖2 pQE-30Xa/HD-5重組質粒表達產物的SDS-PAGE鑒定

2.4 融合蛋白fHD-5純化產物鑒定 Western blot證實純化后的融合蛋白于11 ku處有一條清晰條帶，與預期的目的蛋白相符。見圖3。

Fig.3 Purification confirmed by Western Blot圖3 純化產物Western Blot鑒定

2.5 融合蛋白fHD-5抗真菌活性的初步鑒定 浸泡過fHD-5溶液的濾紙片周圍可見明顯抑菌圈，而陰性對照組則無抑菌圈出現，見圖4。

Fig.4 Antifungal activity examined by disk diffusion圖4 KB紙片法檢測fHD-5抗真菌活性

3 討論

哺乳動物的防御素不但具有抗細菌、真菌及被膜病毒的活性，還對支原體、衣原體、螺旋體及艾滋病病毒具有殺傷作用。此外，防御素作為機體免疫防御系統的重要組成部分，在天然免疫中發揮重要作用的同時，也介導、調節著機體的獲得性免疫[2]。由于HD-5的廣譜抗微生物活性及其分布的特殊性，越來越多的學者認為HD-5與生殖道的感染性疾病密切相關。目前HD-5抗微生物活性的具體機制尚不明確，大多研究認為，其主要的抗微生物活性可能與其所帶電荷有關，HD-5與微生物的細胞膜特異位點接觸后形成電壓依賴通道，使細胞離子通透性失衡，細胞內物質泄漏導致細胞死亡[3]。防御素與傳統抗生素的作用機制不同，可有效避免微生物耐藥性的產生，應用前景良好。

天然的防御素來源少，提取困難，使得防御素的深入研究及應用受到限制。直接從組織中提出操作困難且獲量少，化學合成成本昂貴，基因工程則成為防御素合成的必然選擇。鑒于防御素的獨特抗菌活性，建立能夠高效表達且易于快速分離純化的基因工程表達體系，將為防御素等天然抗菌肽的自動化、產業化生產奠定基礎。已有研究通過酵母表達體系成功的構建了HD-5的真核表達體系并進行相關研究[4]。真核表達系統雖然可以實現有效的轉錄、表達以及翻譯后的后期加工過程，但表達水平一般較低，分離純化困難，從而限制了HD-5的深入研究。

外源基因在大腸桿菌中的融合表達是目前普遍采用的一種高效表達方式。本研究采用pQE30作為HD-5的表達載體，利用載體自帶的T5啟動子，實現目的蛋白的高效表達。pQE30載體在重組蛋白N端融合表達有6個連續的組氨酸標簽（6*His-Tag）。6*His-Tag與細菌的翻譯轉錄機制互相兼容，利于蛋白的表達，并且對目的蛋白的理化性質及結構沒有明顯影響，通過His標簽融合表達的蛋白可以采用固定化金屬離子親和層析純化目的蛋白，使操作十分簡便[5]。E.coli M15菌株是與pQE30表達載體相互匹配的用于表達外源蛋白的宿主菌，其基因組內插入了真核生物稀有密碼子相應的tRNA基因。利用該菌株能更有效地表達目的蛋白。本研究證實，HD-5融合蛋白主要以包涵體形式表達，可以有效地防止蛋白酶對目的蛋白的溶解，降低胞內外源蛋白的濃度，有利于表達產量的提高；包涵體中雜質蛋白含量低，有利于進一步的分離純化。同時包涵體蛋白不具有生理活性，有效降低了HD-5對宿主菌的毒性作用，有利于進一步提高表達產量。包涵體蛋白需進行變性條件下的純化，純化后需對蛋白進行復性。本研究通過NI-NTA親和層析純化目的蛋白，并進行蛋白復性后，獲得了純度較高的HD-5融合蛋白。對融合蛋白進行抗真菌活性的驗證結果顯示含有6*His-Tag的融合蛋白對白色假絲酵母菌具有明顯的抑制作用。相關研究也證實，His-Tag的存在對抗菌肽的抑菌活性并無明顯影響[6]。因此，利用該重組表達體系，可以獲得具有生物活性的HD-5蛋白，還可以通過對誘導條件的不斷優化，進一步提高目的蛋白的產量，進而滿足HD-5深入研究的需求，并為新型抗菌藥物大規模生產途徑的選擇提供實驗基礎。HD-5融合蛋白有效的抗真菌活性，更為婦科生殖道感染性疾病的治療開拓了新的研究方向。

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（2013-10-09收稿 2014-03-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Prokaryotic Expression and Antifungal Activity of Human α Defensin-5 Protein

ZHANG Pingping1,YIN Lirong1,WANG Fang1,SUN Bei2,HUO Yan3
1 Department of Gynecology,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China;2 Research Institute of Endocrinology of Tianjin Medical University;3 Department of Family Planning,the Second Hospital of Tianjin Medical University YIN Lirong,E-mail：yinlirongfk@sina.com

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression vector for HD-5 and purify the recombinant HD-5 protein then analyze its antifungal activity.MethodsThe HD-5 gene was cloned by PCR,then was inserted into prokaryotic expression plasmid pQE-30Xa to construct pQE-30Xa/HD-5.After sequencing,pQE-30Xa/HD-5 was transformed into E.coli M15 cells.Its expression was induced by IPTG and confirmed by SDS-PAGE.The recombinant protein was purified through Ni-NTA affinity purification system.The antifungal activity was tested by disk diffusion method.ResultsHD-5 gene and pQE-30Xa/HD-5 vector were obtained successfully.E.coli M15 strains was used to express HD-5 fusion protein. After purification,the fusion protein was confirmed by Western blot.The disk diffusion test confirmed that the fusion protein can inhibit Candida albicans.ConclusionExpression vector pQE-30Xa/HD-5 was successfully constructed.The HD-5 fusion protein was expressed in E.coli successfully,which showed a certain degree of antifungal activity.

defensins;recombinant fusion proteins;Escherichia coli;human alpha defensin 5；prokaryotic expression；affinity purification；antifungal activity

R711.3,R349.65

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.006

1天津醫科大學第二醫院婦科（郵編300211）；2天津醫科大學內分泌研究所；3天津醫科大學第二醫院計劃生育科

△通訊作者 E-mail：yinlirongfk@sina.com