異丙酚對內毒素誘導人單核細胞系THP-1細胞TREM-1表達的影響

陸立仁 張良清 盧 燕

異丙酚對內毒素誘導人單核細胞系THP-1細胞TREM-1表達的影響

陸立仁1張良清2△盧 燕2

目的 探討異丙酚對內毒素誘導人單核細胞系THP-1細胞髓樣細胞觸發性受體-1（TREM-1）表達的影響。方法培養THP-1細胞，分成7組，分別對應：Control組，單純無血清培養基培養；內毒素（LPS）組，單純LPS 100 μg/L刺激；Pro組，單純加入異丙酚100 μmol/L；P1組，LPS+異丙酚12.5 μmol/L；P2組，LPS+異丙酚25 μmol/L；P3組，LPS+異丙酚50 μmol/L；P4組，LPS+異丙酚100 μmol/L。觀察16 h后收集細胞培養上清液采用ELISA測定腫瘤壞死因子（TNF）-α水平；收集細胞采用流式細胞術檢測TREM-1蛋白表達水平；收集細胞采用實時定量PCR檢測TREM-1 mRNA表達水平。結果與LPS組相比，P3組與P4組的細胞表面TREM-1蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05），細胞上清液中TNF-α水平明顯下降（P＜0.05）；與Control組比較，LPS組TREM-1 mRNA表達明顯增加（P＜0.05）；與LPS組比較，P4組細胞TREM-1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）。結論異丙酚可使LPS誘導的THP-1細胞表面TREM-1蛋白表達水平增加，細胞TNF-α的釋放減少，TREM-1 mRNA的表達量下降。

內毒素類；脂多糖類；二異丙酚；單核細胞；腫瘤壞死因子α；髓樣細胞觸發受體1

膿毒癥是由感染引起的全身性炎癥反應綜合征（SIRS），有細菌或可疑感染灶存在，是由于機體炎癥反應過度或炎癥失控所致。髓樣細胞觸發性受體-1 （TREM-1）是近年發現的表達于髓樣細胞的免疫球蛋白超家族活化受體，可與內毒素（LPS）協同誘導單核細胞促炎細胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1的分泌[1]。近年來逐步證實TREM-1可能觸發并擴大炎癥反應，是介導膿毒性休克的關鍵介質，在膿毒癥的發生發展中起到重要作用[2]。異丙酚是一種新型非巴比妥類靜脈麻醉藥，具有良好的抗氧化作用和抑制細胞因子合成與釋放的功能，它以誘導蘇醒迅速，對心肺功能影響小而在臨床上應用廣泛。本研究通過觀察異丙酚的濃度變化對細胞TREM-1蛋白、mRNA表達以及促炎因子水平的影響，以期探討異丙酚抑制炎性反應的位點及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核細胞系THP-1由南方醫科大學病理生理教研室惠贈。LPS from E.coli 055:B5(L 2880)購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；人TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、Human TREM-1 Phycoerythrin MAb(FAB1278P)、Mouse IgG1 Phycoerythrin Isotype Control（IC002P）均購自美國R＆D公司；PrimeScript RT reagent kit、Sybr primescript RT-PCR kit購自日本TaKaRa公司；引物由廣州Invitrogen公司合成。

1.2 細胞培養與分組 在37℃，5％CO2的培養箱中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養基培養THP-1細胞，行臺盼藍染色后證實存活率達到95％以上。離心收集THP-1細胞，用無血清RPMI-1640培養基洗滌3次后，用無血清RPMI-1640培養基重懸細胞，調節細胞濃度到2.4×106/mL，向每孔加入2 mL細胞懸液，培養過夜。選取24孔培養板分成7組，分別對應：Control組，單純無血清培養基培養；LPS組，單純LPS 100 μg/L刺激；Pro組，單純加入異丙酚100 μmol/L；P1組，LPS+異丙酚12.5 μmol/L；P2組，LPS+異丙酚25 μmol/L；P3組，LPS+異丙酚50 μmol/L；P4組，LPS+異丙酚100 μmol/L。觀察規定的時間后收集細胞培養上清液-70℃保存，采用ELISA檢測TNF-α水平；收集細胞采用流式細胞術（FACS）檢測TREM-1蛋白表達水平；收集細胞采用實時定量PCR （qRT-PCR）檢測TREM-1 mRNA表達水平。

1.3 FACS檢測細胞表面TREM-1蛋白 收集細胞后離心1 500 r/min，5 min，Staining Buffer洗滌3次，調整細胞濃度為4× 106/mL。其中1管加入PE標記的大鼠IgG2A抗體作為同型對照，其余加入PE標記的human anti-TREM-1，2～8℃溫度下孵育30～45 min，Staining Buffer洗滌2次后送流式細胞儀檢測。

1.4 qRT-PCR檢測定TREM-1 mRNA 引物設計參照Gen-Bank中的序列，由廣州Invitrogen生物工程技術服務有限公司合成，TREM-1引物上游5′-CTGAAATCAACCTTACAAATGTGAC-3′，下游5′-GCTCTTACTCAGGAATCCACCA-3′，擴增長度92 bp；內參GAPDH引物上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，擴增長度93 bp。用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA時嚴格按照TaKaRa公司的PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒操作說明進行。qRT-PCR反應嚴格按照TaKaRa公司的SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒操作說明進行；反應條件為：95℃5 min，95℃30 s，62℃15 s，72℃20 s，40個循環，72℃10 min。采用Corbett公司Rotor gene 3000分析系統，通過比較CT值法(2-ΔΔCT法)比較TREM-1相對與GAPDH持家基因的相對表達量。

1.5 ELISA測定上清液中TNF-α水平 將細胞培養上清液從-70℃冰箱取出后室溫下解凍，然后按照人TNF-α ELISA試劑盒操作說明測定上清液中TNF-α水平。

1.6 統計學方法 采用SAS 8.1軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，均數間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各處理組TREM-1蛋白表達水平 與Control組相比，單純LPS處理后，LPS組細胞表面TREM-1蛋白水平明顯下降（P＜0.05），單純異丙酚處理后，Pro組細胞表面TREM-1蛋白表達水平無明顯變化（P＞0.05）。與LPS組相比，異丙酚與LPS共孵育處理下，P1組、P2組細胞表面TREM-1蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05），P3組、P4組的細胞表面TREM-1蛋白水平則明顯增高（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 TREM-1-PE flow cytometry chart in each group圖1 各處理組TREM-1流式細胞圖

Tab.1 Comparison of observation in each group表1 各處理組細胞觀察指標的比較(n=5,±s)

Tab.1 Comparison of observation in each group表1 各處理組細胞觀察指標的比較(n=5,±s)

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與LPS組比較，P＜0.05

組別Control組LPS組Pro組P1組P2組P3組P4組F TREM-1蛋白56.86±4.40 37.18±2.35a53.26±3.65b39.42±2.79a39.12±3.80a45.82±3.11b55.24±4.42b27.41＊＊TREM-1基因1±0 3.73±0.59a1.87±0.36b3.93±0.73a4.14±0.54a3.32±0.60a2.08±0.46b27.42＊＊TNF-α(ng/L) 109.87±9.34 190.35±15.68a105.27±7.83b202.30±19.27a190.33±18.25a126.85±11.25b113.25±7.06b52.37＊＊

2.2 各處理組TREM-1 mRNA表達水平 與LPS組比較，P4組細胞TREM-1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與Control組比較，LPS組TREM-1表達明顯增高（P＜0.05），見表1。

2.3 各處理組上清液中TNF-α水平 與Control組相比，LPS組、P1組、P2組細胞培養上清液中TNF-α水平明顯增高（P＜0.05）。與LPS組比較，P3組、P4組細胞培養上清液中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），見表1。

3 討論

TREM-1是近來發現的中性粒細胞、單核/巨噬等髓樣細胞上表達的表面分子，屬于免疫球蛋白超家族成員[1]。多項研究證實其在炎癥發生與級聯放大效應中起重要作用，是介導膿毒癥發生發展的關鍵分子。異丙酚具有良好的抗氧化作用和抑制細胞因子合成與釋放的功能[3]。但異丙酚是否可通過影響TREM-1而起到抑制炎癥反應及其之間的劑量關系尚少見報道。

本研究顯示，THP-1細胞表面TREM-1一般情況下表達水平較高，而加入LPS后明顯降低，與多項的研究發現相反[4-5]。但Wong-Baeza等[6]采用不同濃度LPS誘導人外周血單核細胞炎性反應，結果顯示細胞表面TREM-1受體隨著LPS濃度的增加而呈下調趨勢，與本研究結果趨勢相一致。而van Bremen 等[7]在嚴重膿毒血癥患者中發現，TREM-1在單核細胞中表達升高，但在中性粒細胞中表達降低。Mazzucchelli等[8]在新生兒膿毒癥中也發現TREM-1在多型核白細胞中表達降低，而CD64表達明顯升高。但Mahdy等[9]用LPS誘導中性粒細胞炎性反應，發現細胞表面的TREM-1受體并未隨著炎性反應的加強而呈現上調趨勢。這可能是由于：（1）本研究所采用的THP-1細胞是一種前單核細胞，與外周血中的單核細胞表面受體表達種類可能存在有一定的差異，TREM-1可能參與細胞分化功能[10]，而Cai等[11]研究發現TREM-1在單核細胞凋亡過程中有重要作用。（2）TREM-1在LPS存在時表達下調也可能是TREM-1受體活性自我限制效應而使機體恢復穩態的一種保護機制[6]。因此，本研究可能提示TREM-1在不同的細胞中參與的反應或者在相互調節通路中所起到的作用并不完全相同。

目前的研究表明，異丙酚可明顯降低血清中炎性因子水平，減弱單核細胞和中性粒細胞的功能，呈現劑量依賴性，從而降低死亡率[12]。本研究發現，單獨異丙酚孵育THP-1細胞，細胞的狀態與Control組無明顯差異，異丙酚并不影響正常狀態下的細胞功能[3]；與LPS組相比發現THP-1細胞中的TREM-1 mRNA在異丙酚孵育中表達量下降，上清液中TNF-α的濃度也降低，這再次證實了異丙酚可明顯降低炎性因子水平，抑制炎性反應。與Mihailidou等[13]的研究相類似，其研究發現在U937單核細胞中，地塞米松可通過TNF-α介導降低TREM-1的基因表達水平。但Dimopoulou等[14]的研究卻發現在嚴重膿毒血癥患者中TREM-1的基因表達量在單核細胞并沒有增加。與LPS組相比發現在異丙酚孵育的THP-1細胞中TREM-1 mRNA的表達量下降，而在THP-1細胞表面TREM-1的蛋白水平卻增加，這可能是由于異丙酚與LPS共同孵育的情況下，THP-1細胞TREM-1蛋白的降解水平也明顯降低，因而雖然TREM-1 mRNA指導TREM-1合成減少，但總趨勢表現為TREM-1蛋白表達量的增加，但具體機制還有待進一步的研究。

綜上，本研究初步證明異丙酚可使LPS誘導的THP-1細胞炎性反應中TNF-α水平降低，抑制TREM-1 mRNA的表達，但沒有相應的抑制細胞表面TREM-1蛋白水平的表達，其確切的分子及生物學機制有待進一步研究。

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（2013-12-17收稿 2014-04-02修回）

（本文編輯 李國琪）

Effects of Propofol on Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1(TREM-1)by Lipopolysaccharide-Stimulated Human Monocyte Cell Lines

LU Liren1,ZHANG Liangqing2,LU Yan2
1 Department of Anesthesia,Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical University,Foshan 528000,China; 2 Department of Anesthesia,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College ZHANG Liangqing,E-mail:983275857@qq.com

ObjectiveTo evaluate the effects of propofol on TREM-1 expression in THP-1 cells stimulated by lipopolysaccharide(LPS).MethodsCells were divided into 7 groups:(1)control group;(2)LPS group that was exposed to LPS in final concentration of 100 μg/L;(3)Progroup that was incubated with 100 μmol/L propofol;(4-7)groups combined 100 μg/L LPS with propofol at different dose of 12.5 μmol/L(P1group),25 μmol/L(P2group),50 μmol/L(P3group),100 μmol/L(P4group)respectively.After 16 hours of incubation,the TNF-α concentration in supernatants were measured by ELISA.TREM-1 expression were examined by FACS and TREM-1 mRNA were detected using qRT-PCR.ResultsTREM-1 on THP-1 increased significantly in group P3and group P4compared with LPS group(P＜0.05).The concentrations of TNF-α in P3and P4(P＜0.05)decreased substantially in supernatant compared with LPS group.TREM-1 mRNA transcription level in group LPS rise considerably(P＜0.05)compared to that in control group,and it dropped greatly in group P4(P＜0.05)compared with that in group LPS.ConclusionPropofol could enhance TREM-1 expression on surface of THP-1 stimulated by LPS.Propofol reduces TNF-α level in culture supernatant.And propofol may restrain TREM-1 mRNA expression.

endotoxins;lipopolysaccharides;propofol;monocytes;tumor necrosis factor-alpha;triggering receptor expressed on myeloid cells 1

R364.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.007

1廣東佛山，南方醫科大學附屬南海醫院麻醉科(郵編528000)；2廣東醫學院附屬醫院麻醉科

△通訊作者 E-mail:983275857@qq.com