第三代端粒酶缺失小鼠皮膚表皮干細胞分離培養特性觀察

張俊伶 黃 頌 路 璐 李德冠 吳紅英 孟愛民

實驗研究

第三代端粒酶缺失小鼠皮膚表皮干細胞分離培養特性觀察

張俊伶 黃 頌 路 璐 李德冠 吳紅英 孟愛民△

目的 觀察第三代端粒酶缺失（G3Terc-/-）小鼠與野生型（WT）小鼠皮膚表皮干細胞數目及功能差異。方法利用流式細胞術對皮膚表皮干細胞進行數目分析及分選；實時定量PCR方法檢測p21基因表達；表皮干細胞克隆形成數目檢測細胞自我更新能力。結果WT小鼠基底部表皮干細胞與基底部上層表皮干細胞比例分別為（9.56±1.06）％和（1.22±0.08）％，在G3Terc-/-小鼠中這兩部分細胞比例分別為（17.36±3.56）％和（2.92±0.72）％；G3Terc-/-小鼠p21相對表達水平為WT小鼠的6.4倍；WT小鼠每104個表皮干細胞能夠形成（280.20±29.81）個克隆，G3Terc-/-小鼠每104表皮干細胞僅能夠形成（29.28±5.24）個克隆，以上結果差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠皮膚表皮干細胞出現衰老性的損傷。

小鼠,基因敲除；皮膚衰老；干細胞；端粒,末端轉移酶

當今社會老齡化現象日益嚴重，有關衰老及衰老相關疾病的分子機制的研究日益受到關注。衰老的標志為器官萎縮、干細胞功能衰退、功能干細胞池耗竭等[1]。皮膚表皮干細胞能夠按照毛發生長循環周期生成新的毛發，也能在皮膚出現創傷時向上遷移，修復受損傷的表皮和皮脂腺，具有多種功能[2]。衰老的皮膚表現為膠原含量減少、彈性降低、干燥及褶皺增多、創傷修復能力減弱等，并可引起機體防御能力減弱及腫瘤易感性增加[3]。因此，研究皮膚表皮干細胞在衰老過程中的變化十分重要。端粒酶缺失小鼠模型是廣泛應用的端粒縮短引起衰老的小鼠模型。第三代端粒酶缺失（G3Terc-/-）及以上的端粒酶缺失小鼠表現出明顯的衰老相關特點[4]。p21基因表達增加是G3Terc-/-小鼠成體細胞衰老的特異性標志[5]。筆者利用端粒酶缺失小鼠模型觀察衰老狀態下皮膚表皮干細胞變化，旨在研究皮膚表皮干細胞衰老及人類衰老過程中皮膚表皮干細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級G3Terc-/-小鼠及同窩對照的野生型（WT）小鼠各5只，40周齡，雄性，WT小鼠平均體質量（30±1）g，G3Terc-/-小鼠平均體質量（20±1）g，飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器 無EDTA胰酶購自Gibco公司；CD49f-PE 和CD34-FITC抗體購自eBioscience公司；RNA提取試劑盒及cNDA反轉錄試劑盒購自Takara公司；p21熒光標記探針和GAPDH熒光標記探針購自ABI公司；表皮干細胞克隆形成培養基購自Cellntec公司；熒光定量PCR儀，ABI公司，型號7500；流式細胞儀，BD公司，型號AriaⅡ。

1.3 實驗方法

1.3.1 皮膚表皮細胞分離 脫臼處死小鼠，將小鼠軀干皮膚用手術剪分離剪斷，參照文獻[6]中的方法分離獲取皮膚表皮細胞。

1.3.2 皮膚表皮干細胞抗體染色及流式細胞儀分選 將1.3.1中獲取到的1 mL皮膚表皮細胞懸液計數，計算每個樣本（WT與G3Terc-/-各5個樣本）5×106個細胞加入至1.5 mL離心管內，再次以1 500 r/min離心5 min，去上清液。加入50 μL含0.5％BSA的PBS緩沖鹽溶液，然后分別加入CD49f-PE抗體4 μL和CD34-FITC抗體5 μL，冰上避光孵育1 h。孵育抗體結束后用5 mL含0.5％BSA的PBS緩沖鹽溶液洗2次，加入300 μL PBS進行流式細胞儀分選皮膚表皮干細胞。

1.3.3 實時定量PCR檢測p21基因表達 流式細胞儀分選出5 000個基底部表皮干細胞，使用RNA提取試劑盒及cNDA反轉錄試劑盒進行RNA提取及cDNA合成。紫外分光光度計檢測合成后的cDNA濃度并將樣本調成相同濃度。取9 μL cDNA樣本，以GAPDH作為內參，p21檢測組加入10 μL實時定量PCR混合試劑，1 μL p21熒光標記探針；GAPDH檢測組加入10 μL實時定量PCR混合試劑，1 μL GAPDH熒光標記探針。按照ABI7500實時定量PCR儀標準程序進行基因表達檢測。檢測結果以2-ΔΔCt方法進行計算以觀察p21基因表達差異。

1.3.4 WT與G3Terc-/-小鼠皮膚表皮細胞克隆培養 胚胎成纖維細胞作為滋養層細胞接種于6孔板內培養2 d，按照1.3.1中的方法獲取新生鼠皮膚表皮細胞，以每孔2 000個表皮細胞接種至已有滋養層細胞的6孔板內，加入2 mL表皮干細胞克隆形成培養基，隔天換液，培養7 d后計數克隆形成數目[7]。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0對數據進行處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示。2組間均數比較采用獨立樣本均數t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組小鼠皮膚表皮干細胞數目比較 與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠皮膚基底部表皮干細胞（CD49f-PE陽性同時CD34-FITC陽性細胞群）及基底部上層表皮干細胞（CD49f-PE陽性同時CD34-FITC陰性細胞群）比例明顯增多，見圖1、表1。

Fig.1 Representative image of epidermal stem cell flow cytometry圖1 表皮干細胞流式細胞儀分析示意圖

Tab.1 Comparing ratios of epidermal stem cell between two groups of mice表1 2組小鼠皮膚表皮干細胞比例比較（n=5，％，±s）

Tab.1 Comparing ratios of epidermal stem cell between two groups of mice表1 2組小鼠皮膚表皮干細胞比例比較（n=5，％，±s）

＊＊P＜0.01

組別WT小鼠G3Terc-/-小鼠t基底部表皮干細胞比例9.56±1.06 17.36±3.56 4.690＊＊基底部上層表皮干細胞比例1.22±0.08 2.92±0.72 5.277＊＊

2.2 2組小鼠皮膚表皮干細胞p21基因表達水平比較 與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠基底部表皮干細胞p21相對基因表達水平明顯增高，為WT小鼠的6.4倍，見圖2。

Fig.2 Relative expression of p21 level of epidermal stem cell in two groups of mice圖2 2組小鼠皮膚表皮干細胞p21表達水平比較

2.3 2組小鼠表皮干細胞形成克隆能力比較 與WT小鼠比較，G3Terc-/-新生鼠皮膚表皮干細胞克隆形成數目明顯減少（[29.28±5.24）個/104vs（280.20± 29.81）個/104，t=18.533，P＜0.01]，克隆形成能力明顯下降，見圖3。

Fig.3 Microscope image of colonies obtained from isolated keratinocytes from two groups of mice(×4)圖3 2組小鼠皮膚表皮干細胞形成克隆顯微鏡下觀察圖（×4）

3 討論

3.1 皮膚表皮干細胞與毛發生長周期 毛發生長周期可分為生長期、退行期和休眠期。不同類型的表皮干細胞在毛發生長周期發揮著不同的作用。表皮干細胞可以通過對CD34和CD49f兩種抗原的檢測而分離開來，CD34和CD49f兩種抗原均高表達的基底部表皮干細胞是出現在休眠期的細胞，CD34高表達而CD49f低表達的基底部上層表皮干細胞是出現在生長期的細胞[2]。

3.2 衰老狀態下皮膚表皮干細胞數目及功能變化 本研究顯示，與WT小鼠比較，G3Terc-/-小鼠基底部表皮干細胞和基底部上層表皮干細胞比例均明顯增加，p21基因相對表達水平提高，表皮細胞形成克隆數目顯著降低，每個克隆的體積顯著減小，說明在衰老狀態下，皮膚表皮干細胞數目應激性增加以應對在衰老時出現的各種外部因素刺激。之前有研究提示，在外部因素刺激下，與WT小鼠相比G3Terc-/-小鼠表皮干細胞表現出動員能力嚴重減弱和對增殖應答反應遲鈍[8]，提示增加的細胞數目并不能緩解衰老引起的表皮干細胞功能受損[9]。與以往研究一致的是，與年輕小鼠（2月齡的C57/BL6小鼠）相比，自然衰老小鼠（18月齡的C57/BL6小鼠）同樣出現皮膚表皮干細胞數目增多及功能下降[10]，說明衰老確實引起皮膚表皮干細胞損傷。

3.3 本研究的意義 本研究通過對衰老模型小鼠皮膚表皮干細胞的研究，建立了表皮干細胞分離培養方法，揭示了衰老小鼠表皮干細胞數目和功能變化以及衰老激活的相關信號通路變化，為衰老與表皮干細胞關系的研究奠定了基礎，也為抗衰老相關藥物研發提供模型依據。

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（2013-12-30收稿 2014-03-03修回）

（本文編輯 李鵬）

Isolation and Culture of Epidermal Stem Cells from the Third Generation of Mice That Were Knocked-out of Terc

ZHANG Junling,HUANG Song,LU Lu,LI Deguan,WU Hongying,MENG Aimin
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,the Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China MENG Aimin,E-mail：ai_min_meng@126.com

ObjectiveTo observe the difference in number of epidermal stem cell and its function between wildtype(WT)mice and the third generation of Terc knockout(G3Terc-/-)mice.MethodsFlowcytometry was used to analyse and sort epidermal stem cells;Quantitative real-time PCR is used to analyse the relative expression level of p21 in epidermal stem cells;Self-renewal ability was reflected by the number of colonies formed by epidermal stem cells.ResultsBasal and suprabasal ratios in epidermal stem cells in WT mice were(9.56±1.06)％and(1.22±0.08)％respectively;basal and suprabasal ratios in epidermal stem cell in G3Terc-/-mice were(17.36±3.56)％and(2.92±0.72)％respectively.Relative p21 expression level in G3Terc-/-mice was 6.40 fold to WT mice;Number of colonies formed by WT mice epidermal stem cells were(280.20±29.81)per 104cell,number of colonies formed by G3Terc-/-mice epidermal stem cells were(29.28±5.24)per 104cell,which present significant difference to each other（P＜0.05）.ConclusionCompared to WT mice,epidermal stem cells in G3Terc-/-mice were aging.

mice,knockout；skin aging；stem cells；telomerase

Q255

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.008

國家973重大專項資助項目（2011CB964800-G）；國家自然科學基金海外合作基金（81129020）；國家自然基金面上項目（81072237,81372928）；天津市重點基金資助項目（11JCZDJC19100）；教育部高等學校博士學科點專項基金（20111106110038）

中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室（郵編300192)

△通訊作者 E-mail：ai_min_meng@126.com