低頻電刺激腳橋核對蒼白球內側部神經元自發放電的影響

郭 佳 林宇涵 李 垚 焦金菊

低頻電刺激腳橋核對蒼白球內側部神經元自發放電的影響

郭 佳 林宇涵 李 垚△焦金菊△

目的 通過觀察低頻電刺激帕金森病（PD）模型大鼠腳橋核（PPN）對蒼白球內側部（GPi）神經元放電的影響，探討低頻電刺激PPN治療PD的作用機制。方法30只SD大鼠隨機分為對照組和PD組各15只。大鼠腦右側黑質致密部注入6-羥基多巴胺建立PD模型；采用細胞外記錄方法，利用7管玻璃微電極記錄觀察低頻電刺激、微電泳谷氨酸（Glu）及其受體阻斷劑MK-801、γ-氨基丁酸（GABA）及其受體阻斷劑荷包牡丹堿（BIC）對大鼠GPi神經元放電頻率的影響。結果低頻電刺激PPN，對照組及PD組大鼠GPi神經元反應均以抑制為主，且平均放電頻率均較刺激前降低（P＜0.01）；微電泳Glu和BIC對神經元有興奮作用，而微電泳MK-801和GABA對神經元有抑制作用。在微電泳BIC的興奮作用的基礎上低頻電刺激PPN使神經元放電頻率明顯降低，而在微電泳MK-801抑制作用的基礎上低頻刺激PPN使神經元放電頻率進一步降低。結論低頻電刺激PPN可抑制GPi神經元活動，可能是通過調節投射到GPi神經元的Glu和GABA神經通路實現的。

帕金森病；電刺激；腦橋腳被蓋核；蒼白球；谷氨酸；γ氨基丁酸；腦橋核；微電泳

帕金森病（PD）是常見的慢性中樞神經系統退行性病變，一般認為黑質致密部（SNc）多巴胺（DA）能神經元變性是其發病的主要原因[1]。雖然腦深部電刺激丘腦底核治療PD效果良好，但不能明顯改善PD步態障礙和靜止震顫等運動特性[2]。腳橋核（PPN）作為大腦網狀激活系統的一部分，能誘導并維護運動[3]。動物實驗證明病變或者高頻刺激能夠導致PPN的失活，引發運動障礙，這種現象可以被低頻刺激還原[4]。本研究觀察低頻電刺激PPN對蒼白球內側部（GPi）神經元放電的影響，并結合微電泳來探討低頻電刺激PPN改變GPi神經元放電頻率的可能機制，為臨床治療PD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 SD大鼠30只，體質量250～300 g，購自遼寧醫學院實驗動物中心。應用配對設計方法將實驗大鼠隨機分為對照組和PD組各15只，每組雌雄比例一致，標準環境飼養。6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿普嗎啡（APO）、谷氨酸（Glu）、MK-801、γ-氨基丁酸（GABA）、荷包牡丹堿（BIC）均購自美國Sigma公司，其余試劑均由遼寧醫學院生理實驗室提供。

1.2 PD大鼠模型建立 經4％水合氯醛（8 mL/kg）腹腔麻醉后，用腦立體定位儀（美國WPI公司）對大鼠頭顱進行水平固定。剪毛，常規消毒后，沿顱頂正中切2 cm長縱向切口，依次切開頭皮及皮下組織，暴露前囟和后囟位點，根據《Paxinos ＆Watson大鼠腦圖譜》確定右側黑質致密部兩點坐標：（1）AP-5.3 mm，ML 2.1 mm VD 7.1 mm。（2）AP-5.3 mm，ML 2.6 mm，VD 6.8 mm。將2 μL 6-OHDA分別注射于2個靶點，注射完畢后留針10 min，緩慢退針縫合傷口，腹腔注射青霉素預防感染。術后3周，大鼠頸背部皮下注射0.05％阿普嗎啡（0.5 mL/kg），誘發大鼠旋轉行為。5 min后開始觀察并記錄旋轉圈數。以健側后肢為支點原地旋轉，首尾相接360°為1圈，記錄30 min大鼠旋轉次數，7圈/min以上大鼠為成功PD模型，用于實驗。

1.3 電刺激 用20％烏拉坦（0.75 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，顱部水平固定于腦立體定位儀。將刺激電極插入大鼠腦PPN核團（AP-8.0 mm，ML 1.9 mm，VD 6.6 mm）。刺激強度0.6 mA，波寬0.06 ms，刺激時程5 s，刺激頻率為25 Hz。

1.4 神經元放電及微電泳 自制7管玻璃微電極，尖端直徑小于2 μm，中心管電阻5～10 MΩ，管內充入含0.1％滂胺天藍的3 mol/L NaCl溶液。外周管電阻20～100 MΩ，根據微電泳實驗分別注入Glu（1.0 mol/L，pH 8.0）、MK-801（0.01 mol/L，pH 4.0）、GABA（0.2 mol/L，pH 3.5）、BIC（0.01 mol/L，pH 4.0）。用6400A微電泳儀（美國Dagan公司）進行微電泳，用微電極推進器（美國Dagan公司）將玻璃電極緩慢推入GPi （AP-2.4 mm，ML 2.3～3.0 mm，VD 6.6～7.3 mm）。記錄其放電活動。滯留電流為5～10 nA，不同試劑的微電泳電流均在5～100 nA之間，Glu用負電流泳入，其余為正電流。

神經元放電經DAM80微電極放大器（美國WPI公司）引導、濾波后顯示于示波器，用Spike2生物信號處理系統（美國CED公司）記錄儲存。實驗過程中，只對放電穩定且信噪比＞3∶1的放電信號進行記錄。為排除可能發生的電流作用，只要泳入NaCl引起放電變化，該數據不計入統計。

神經元放電頻率（R）的改變根據下列公式判斷：R=（處理后放電頻率/處理前放電頻率-1）×100％，R＞20％為興奮反應：R＜-20％為抑制性反應；介于兩者之間為無反應。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，所得數據以±s表示。組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低頻電刺激PPN對GPi神經放電元影響 對照組大鼠GPi神經元30個，PD組大鼠GPi神經元26個。低頻電刺激PPN后，對照組大鼠GPi神經元27個為抑制反應，1個興奮，2個無反應；PD組大鼠GPi神經元有24個抑制，1個興奮，2個無反應。2組大鼠GPi神經元在低頻電刺激后均以抑制性為主，見圖1。

Fig.1 After low-frequency electrical stimulation of PPN,GPi neuronal present inhibitory response圖1 低頻電刺激大鼠PPN后GPi神經元抑制性反應

低頻刺激PPN前，PD組GPi神經元基礎放電頻率（Hz）較對照組明顯增高（[15.34±3.12）vs（12.34± 2.53），t＝2.334，P＜0.05]；刺激后PD組放電頻率（4.52±1.75）和對照組放電頻率（2.25±1.12）較刺激前均有明顯降低（t分別為4.873、6.113，P＜0.01）。

2.2 微電泳Glu和MK-801對GPi神經元放電影響 觀察26個GPi神經元對微電泳Glu的反應，92％的神經元表現為明顯興奮反應，平均放電頻率由（6.34±0.32）Hz增至（19.35±1.20）Hz（n＝24，t= 15.435，P＜0.01）。在25個神經元中，微電泳Glu受體阻斷劑MK-801使88％的神經元表現為抑制反應，平均放電頻率由（6.34±0.32）Hz降至（3.14±0.10）Hz（n＝22，t=21.011，P＜0.01）。而且Glu對神經元的興奮效應可被MK-801阻斷，見圖2。

Fig.2 Effect of microiontophoresis Glu and MK-801 on rat GPi neurons圖2 微電泳Glu和MK-801對大鼠GPi神經元放電影響

2.3 微電泳GABA和BIC對大鼠GPi神經元放電影響 觀察28個GPi神經元對微電泳GABA的反應，93％的神經元表現為明顯抑制反應，平均放電頻率由（4.46±0.8）Hz降至（1.66±0.32）Hz（n＝26，t=8.287，P＜0.01）。在25個神經元中，微電泳GABA受體阻斷劑BIC使92％的神經元表現為興奮反應，平均放電頻率由（4.46±0.8）Hz增至（18.21±2.03）Hz（n＝23，t=4.938，P＜0.01，）。而且GABA對GPi神經元的抑制效應可被BIC阻斷，見圖3。

Fig.3 Effect of micro-electrophoresis and BIC on rat GABA on GPi Neuron圖3 微電泳GABA和BIC對大鼠GPi神經元放電影響

2.4 微電泳MK-801和BIC過程中低頻刺激PPN對GPi神經元放電影響 在對照組大鼠15個GPi神經元中，微電泳MK-801和BIC過程中低頻電刺激PPN，86％神經元出現了進一步的抑制反應，放電頻率由（3.02±0.55）Hz變化到（1.25±0.43）Hz（n＝13，t= 8.247，P＜0.05）；93％神經元在興奮的基礎上出現了明顯的抑制反應，放電頻率由（5.46±0.8）Hz降至（1.66±0.32）Hz（n＝14，t=9.615，P＜0.01）。在PD組大鼠17個神經元中，94％神經元出現了進一步的抑制反應，放電頻率由（9.45±0.67）Hz變化到（1.32± 0.44）Hz（n＝16，t=9.485，P＜0.01）；88％神經元在BIC興奮的基礎上出現明顯抑制，放電頻率由（10.24±1.2）Hz降至（1.12±0.22）Hz（n＝15，t=22.221，P＜0.01），見圖4、5。

Fig.4 Response of GPi neurons to low-frequency micro-electrophoresis MK-801 stimulation on PPN圖4 微電泳MK-801 GPi神經元對低頻刺激PPN反應

Fig.5 Response of GPi neurons to low-frequency micro-electrophoresis BIC stimulation on PPN圖5 微電泳BIC GPi神經元對低頻刺激PPN反應

3 討論

在PD狀態下，由于SNc中DA能神經元缺少，一方面通過SNc-紋狀體（Striatum，Str）-蒼白球外側部（Globus pallidus external，Gpe）-STN間接通路使STN去抑制，并通過STN-GPi/SNr的Glu能投射使GPi活動進一步增強。另一方面通過SNc-Str-GPi/SNr直接通路，使Str-GPi/SNr的GABA能投射減少以使GPi/SNr去抑制。最終結果均導致GPi過度興奮，Gpi/SNr過強的GABA能神經通路使皮質對運動的發動受到抑制而產生PD癥狀。已有實驗證明，高頻電刺激PPN能夠增加GPi神經元活動[5]，從理論上說并不能改善PD狀態下GPi神經元的過度興奮，而本研究中采用低頻電刺激PPN，發現GPi神經元放電活動受到抑制，提示可以改善PD。

本研究在微電泳MK-801和BIC的基礎上給予低頻電刺激PPN，結果顯示在微電泳MK-801抑制GPi神經元放電的基礎上，給予低頻刺激PPN，GPi神經元放電頻率進一步降低，提示投射到GPi的Glu能減少，從而來抑制GPi活動。然而已有實驗證明低頻電刺激PPN可以興奮STN神經元[6]。PPN的上行非膽堿能投射通路同時投射到蒼白球、黑質致密部和STN，而PPN到STN的投射大部分是PPN到GPi投射的分支，筆者推斷雖然低頻電刺激PPN能夠興奮STN神經元，使其投射到GPi的Glu含量增加，但是PPN-GPi的直接通路作用更加明顯，最終結果在微電泳實驗上顯示為GPi內的Glu含量較低頻刺激前減少。

而在微電泳BIC興奮GPi神經元的基礎上，低頻電刺激PPN，可使GPi神經元放電頻率明顯降低，推斷可能是電刺激PPN，一方面改變PPN的放電模式，使PPN投射至GPi的膽堿能抑制突出前GPi/SNr的GABA能神經末梢的突出前膜受體[7]，抑制GABA到PPN的投射，也有可能是通過SNc-Str-GPi/SNr直接通路的調節，使Str-GPi/SNr的GABA能投射增加[8]，通過增加GABA的釋放抑制了GPi神經元的活動，從而釋放丘腦-皮質通路，使相應運動皮質活動提高而改善PD癥狀。

本研究證明了低頻電刺激PPN能夠通過Glu能神經投射的減少和GABA能投射的增加，降低了PD大鼠GPi神經元的電生理活動從而改善PD癥狀，為低頻電刺激PPN治療PD提供了依據。

[1]Acar F,Acar G,Bir LS,et al.Deep brain stimulation of the pedunculopontine nucleus in a patient with freezing of gait[J].Stereotact Funct Neurosurg,2011,89(4):214-219.

[2]Rodriguez-Oroz MC,Obeso JA,Lang AE,et al.Bilateral deep brain stimulation in Parkinson’s disease:a multicentre study with 4 years follow-up[J].Brain,2005,128(2):2240-2249.

[3]Takakusaki K.Forebrain control of locomotor behaviors[J].Brain, 2008,57(17):192-198.

[4]Nandi D,Aziz TZ,Giladi N,et al.Reversal of akinesia in experimental Parkinsonism by GABA antagonist microinjections in the pedunculopontine nucleus[J].Brain,2002,125(14):2418-2430.

[5]Liu MJ,Jiao JJ,Li Y,et al.Effect of high-frequency stimulation in the pedunculopontine nucleus on neuronal activity and neurotransmitters in the globus pallidus internus of rats[J].Tianjin Med J,2013,41 (7):682-685.[劉敏杰,焦金菊,李垚,等.高頻電刺激腳橋核對蒼白球內側部氨基酸類遞質及神經元放電的影響[J].天津醫藥, 2013,41(7):682-685.]

[6]Capozzo A,Florio T,Confalone G,et al.Low frequency stimulation of the pedunculopontine nucleus modulates electrical activity of subthalamic neurons in the rat[J].Neural Transm,2009,116(1):51-56.

[7]Aravamuthan BR,McNab JA,Miller KL，et al.Cortical and subcortical connections within the pedunculopontine nucleus of the primate Macaca mulatta determined using probabilistic diffusion tractography[J].Clin Neurosci,2009,16(3):413-420.

[8]Warren NM,Piggott MA,Lees AJ,et al.Muscarinic receptors in the thalamus in progressive supranuclear palsy and other neurodegenerative disorders[J].Neuropathol Exp Neurol,2007,66(5):399-404.

（2014-01-08收稿 2014-05-07修回）

（本文編輯 李國琪）

Effects of Low-Frequency Stimulation of Pedunculopontine Nucleus on Spontaneous Discharges of Globus Pallidus Internus

GUO Jia,LIN Yuhan,LI Yao,JIAO Jinju
Department of Physiology,Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,China LI Yao,E-mail:liyaoliaoyi@163.com;JIAO Jinju,E-mail:jinjujiao@126.com

ObjectiveTo explore the mechanism of the low-frequency electrical stimulate on pedunculopontine nucleus to treat the Parkinson(PD)through observinge the low-frequency electrical stimulation of Pedunculopontine Nucleus (PPN)in PD rat model and the effects of neurotransmitters(GPi)neurons discharge in the medial part of the globus pallidus.MethodsThirty SD rats were randomly assigned to the control group and the PD model group,with 15 in each group.PD model was established through injecting 6-OHDA into Substantia nigra compact(SNc)of black rat.Effect of low frequency electrical stimulation,micro-electrophoresis glutamate(Glu)and its receptor blocking breaking agent MK-801,γ-aminobutyric acid(GABA)and its receptor antagonist bicuculline(BIC)on discharge of rat neuron GPi was examined using extracellular unit recording methods through seven glass microelectrode recording.ResultsWhen stimulated by low frequency electrical stimulation of PPN,reactions from the control group and neuronal response GPi in PD rats were inhibited.The average discharge frequency was reduced compared to pre-stimulation(P＜0.01).Micro-electrophoresis and BIC Glu excite neurons while microiontophoresis MK-801 and GABA restrain neurons.In the background of micro-electrophoresis BIC’s excitatory effects on neuron,low-frequency electrical stimulation on PPN reduced neuronal firing frequency.And in the background of inhibition effect of micro-electrophoresis MK-801,low-frequency stimulation PPN further restrain neuronal discharge frequency.ConclusionLow frequency electrical stimulation inhibits GPi PPN neuronal activity probably though regulating neurons projecting to the Glu and GABA nerve pathways in GPi neuron.

Parkinson disease;electric stimulation;pedunculopontine tegmental nucleus;globus pallidus;glutamic acid;gamma-aminobutyric acid;pedunculopontine pucleus;microiontophoresis

R742

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.011

遼寧省教育廳科研項目(L2010252)

遼寧錦州，遼寧醫學院生理學教研室(郵編121001)△

E-mail:liyaoliaoyi@163.com;jinjujiao@126.com