無羈萜-3β-醇抑制自身免疫性腦脊髓炎的作用研究

郭喜霞楊 靜黃 寧萬仁玲李昭輝許高威尹雅玲△ 李 鵬

無羈萜-3β-醇抑制自身免疫性腦脊髓炎的作用研究

郭喜霞1楊 靜2黃 寧1萬仁玲1李昭輝1許高威1尹雅玲1△李 鵬1

目的 研究無羈萜-3β-醇對實驗誘導的豚鼠自身免疫性腦脊髓炎（AE）的抑制作用。方法用25、50 和100 mg∕kg劑量的無羈萜-3β-醇對實驗誘導的AE豚鼠進行灌胃8周。分別檢測血漿CD4+∕CD8+，白細胞介素（IL）-1、2、6、10，血漿神經肽Y（NPY）、β-內啡肽（β-EP），腦組織轉化生長因子（TGF）-β、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、一氧化氮合酶（NOS）及白細胞分化抗原CD3的含量。光鏡觀察豚鼠大腦神經元形態學變化，電鏡觀察神經元超微結構變化，免疫熒光觀察NOS在神經元的表達。結果無羈萜-3β-醇抑制實驗誘導的AE豚鼠CD4+∕CD8+的升高，抑制血漿IL-1、2、6、10的含量升高，抑制血漿NPY升高及β-EP降低，抑制大腦TGF-β降低和MMP-2、CD3升高以及NOS在神經元胞質內的表達，并維持神經元的正常形態。結論無羈萜-3β-醇具有抑制AE的作用。

腦脊髓炎,自身免疫性,實驗性；白細胞介素類；受體,細胞因子；神經肽Y；轉化生長因子β；基質金屬蛋白酶2；一氧化氮合酶；抗原,CD；神經元；無羈萜-3β-醇

自身免疫性腦脊髓炎（autoimmune encephalomyelitis，AE）是由CD4+T淋巴細胞介導的慢性變態反應性疾病，臨床上常出現神經功能進行性障礙、肌肉無力、肢體癱瘓等癥狀[1]。目前，AE在臨床上尚無特殊藥物治療方法，常用腎上腺皮質激素抗免疫治療，同時聯合使用ATP、輔酶A、腺苷、胞二磷膽堿等藥物，以促進神經功能的恢復。有學者報道，無羈萜-3β-醇具有抗氧化[2]、抗炎、抗免疫作用[3]，可能在治療免疫系統疾病方面發揮一定的作用[4]。本研究在實驗誘導的AE豚鼠模型基礎上，觀察無羈萜-3β-醇對AE的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性英國種短毛豚鼠，5周齡，體質量 220～250 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SYXK-豫-005-0012。動物房溫度18～20℃，環境潔凈度5 000～8 000級，相對濕度40％～50％，換氣次數20次∕h，氣流速度0.15～0.2 m∕s，多級定向控制空氣壓差10％～15％，自動定時器控制7：00—19：00為光照期、19：00—07：00為黑暗期，常規豚鼠飼料及二次凈化水飼養。

1.1.2 藥品試劑 無羈萜-3β-醇（長沙麗欣生物制劑有限公司）；醋酸潑尼松（武漢述元科技發展有限公司）；腦組織轉化生長因子（TGF）-β、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、白細胞分化抗原CD3一抗及辣根過氧化酶標記二抗（碧云天生物技術研究所）；一氧化氮合酶（NOS）一抗及熒光標記二抗（Sigma公司）；白細胞介素（IL）-1、2、6、10 ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；血漿神經肽Y（NPY）、β-內啡肽（β-EP）放射免疫試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 主要儀器 FACScan型流式細胞儀、γ計數儀（美國Becton-Dickinson公司）；Synergy H4全功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；尼康90I熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 AE豚鼠模型制備 （1）豚鼠全脊髓勻漿制備：豚鼠腹腔注射5 mL∕kg氯胺酮麻醉，在無菌操作下，清理皮毛，依次打開腹腔、胸腔，剪斷兩側肋骨，用鈍頭針從左心室進針穿至主動脈。先用生理鹽水灌注600 mL，再用4％多聚甲醛灌注固定。組織剪經頭部沿枕骨大孔處剪斷，剝取腦和脊髓并去掉脊膜與馬尾后稱質量，按照1∶3質量比加入生理鹽水并制備成25％的豚鼠全脊髓勻漿。完全弗氏佐劑和豚鼠全脊髓勻漿以1∶2充分乳化制備成穩定的豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑待用。（2）AE模型制備：豚鼠腹腔注射5 mL∕kg氯胺酮麻醉，將豚鼠全脊髓勻漿抗原乳按照1 mL∕kg的劑量皮下注入豚鼠兩個后足墊皮內，同時左后肢足背皮下注射2 mL∕kg百日咳原漿液，誘導AE模型。免疫后每籠6只常規飼養。

1.2.2 實驗設計與分組 30只實驗豚鼠按照隨機數字表分5組，每組6只，實驗中AE模型全部成功。（1）正常對照組：后足墊皮內注射等量生理鹽水（1 mL∕kg）。（2）AE模型組：按照本實驗操作規定，后足墊皮內注射豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑（1 mL∕kg）。（3）醋酸潑尼松組：在AE模型組基礎上，當日灌胃醋酸潑尼松2 mg∕（kg·d），灌胃持續8周。（4）無羈萜-3β-醇低、中、高濃度組：在AE模型組基礎上，當日分別灌胃無羈萜-3β-醇25、50、100 mg∕（kg·d），灌胃持續8周。第8周后，5 mL∕kg乙醚麻醉豚鼠，內眥采血，加肝素抗凝，取組織，甲醛或戊二醛固定，或液氮凍存以待指標檢測。

1.2.3 血漿CD4+、CD8+含量及CD4+∕CD8+檢測 取100 μL抗凝血加入20 μL抗豚鼠CD4+及CD8+抗體均勻混合，室溫避光20 min后加入溶血素2 mL，繼續避光20 min；3 000 r∕min離心5 min后棄去上清液，用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+含量及CD4+∕CD8+值。

1.2.4 血漿IL-1、2、6、10含量檢測 按照ELISA試劑盒操作說明要求操作。酶標儀450 nm單波長下讀取標準管及測試管光密度（OD）值，采用SPSS14.0擬合直線并讀取相應數值，求出血漿IL-1、2、6、10含量。

1.2.5 血漿NPY、β-EP含量檢測 按照放射免疫試劑盒說明書要求操作。測試樣本在4℃冰箱過夜24 h，加入分離劑并充分混勻。室溫放置20 min后4℃恒溫3 000 r∕min離心20 min，棄去上清液。在γ計數儀上檢測血漿NPY、β-EP的含量。

1.2.6 腦組織TGF-β、MMP-2、NOS、CD3檢測 按照免疫組化試劑盒說明書要求操作。組織抗原和一抗、二抗結合后顯色，通過計算機輔助顯微計數，在200倍光鏡下，每張切片隨機讀取5～10個視野，每個視野計數50個胞漿呈棕黃色的陽性細胞，對TGF-β、MMP-2、NOS、CD3進行半定量檢測。

1.2.7 神經元形態觀察 取甲醛固定組織塊，石蠟包埋，制作3～4 μm厚切片，經HE染色后在光學顯微鏡下觀察。取液氮凍存組織塊，戊二醛固定，制作0.5 mm3電鏡切片，經透射電鏡下觀察。

1.2.8 NOS在神經元胞質內的表達 取液氮凍存組織塊，制作冰凍切片。分別用1∶800的NOS一抗以及熒光標記的二抗孵育，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS 14.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示。組間比較用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q法；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿CD4+、CD8+含量及CD4+∕CD8+值檢測 與正常對照組比較，AE模型組CD4+細胞數明顯升高，CD8+細胞數明顯降低，CD4+∕CD8+比值升高；醋酸潑尼松與無羈萜-3β-醇明顯抑制AE豚鼠CD4+升高、CD8+降低、CD4+∕CD8+升高，見表1。

Tab.1 Comparison of the plasma CD4+,CD8+cell count and the CD4+/CD8+value among five groups表1 各組血漿CD4+、CD8+細胞數以及CD4+/ CD8+比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of the plasma CD4+,CD8+cell count and the CD4+/CD8+value among five groups表1 各組血漿CD4+、CD8+細胞數以及CD4+/ CD8+比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與AE模型組比較，c與醋酸潑尼松組比較，P＜0.05；表2～4同

組別正常對照組AE模型組醋酸潑尼松組無羈萜-3β-醇低濃度組無羈萜-3β-醇中濃度組無羈萜-3β-醇高濃度組F CD4+（×109∕L）42.64±1.65 52.76±2.64a44.57±1.54ab50.65±4.45abc45.54±1.44abc44.43±3.13abc31.675＊＊CD8+（×109∕L）24.76±1.75 18.66±0.87a24.64±2.56b19.47±2.57abc23.57±1.67abc28.76±1.69abc32.341＊＊CD4+∕CD8+1.65±0.28 2.85±0.37a1.96±0.24ab2.54±0.24abc2.47±0.28abc1.99±0.97abc27.654＊

2.2 血漿IL-1、IL-2、IL-6、IL-10的含量檢測 與正常對照組比較，AE模型組外周血IL-1、IL-2、IL-6、IL-10含量明顯升高；醋酸潑尼松與無羈萜-3β-醇可明顯降低外周血IL-1、IL-2、IL-6、IL-10含量，見表2。

2.3 血漿NPY、β-EP的含量檢測 與正常對照組比較，AE模型組外周血神經遞質NPY含量明顯升高、β-EP含量明顯降低；醋酸潑尼松與無羈萜-3β-醇可明顯抑制外周血神經遞質NPY含量升高、β-EP含量降低，見表3。

Tab.2 Comparison of plasma levels of IL-1,IL-2, IL-6,IL-10 among five groups表2 各組血漿IL-1、IL-2、IL-6、IL-10的含量比較（n=6，ng∕L,±s）

Tab.2 Comparison of plasma levels of IL-1,IL-2, IL-6,IL-10 among five groups表2 各組血漿IL-1、IL-2、IL-6、IL-10的含量比較（n=6，ng∕L,±s）

組別正常對照組AE模型組醋酸潑尼松組無羈萜-3β-醇低濃度組無羈萜-3β-醇中濃度組無羈萜-3β-醇高濃度組F IL-1 1.75±0.35 14.96±0.65a7.75±0.93ab12.76±0.35abc10.63±0.44abc8.89±0.87abc34.453＊＊IL-2 6.66±1.04 12.56±1.65a9.46±1.53ab11.82±0.83abc10.32±1.21abc9.89±1.77abc29.349＊組別正常對照組AE模型組醋酸潑尼松組無羈萜-3β-醇低濃度組無羈萜-3β-醇中濃度組無羈萜-3β-醇高濃度組F IL-6 3.74±0.30 7.44±1.04a4.47±0.48ab7.66±0.56abc5.87±0.67abc4.65±0.67abc36.232＊＊IL-10 665.76±32.65 1 244.55±98.34a1 046.55±87.35ab1 187.54±65.45abc1 167.65±89.43abc1 095.33±124.34abc27.665＊

Tab.3 Comparison of the plasma neurotransmitter content of NPY and β-EP among five groups表3 各組血漿神經遞質NPY、β-EP的含量比較 （n=6，ng∕L，±s）

Tab.3 Comparison of the plasma neurotransmitter content of NPY and β-EP among five groups表3 各組血漿神經遞質NPY、β-EP的含量比較 （n=6，ng∕L，±s）

組別正常對照組AE模型組醋酸潑尼松組無羈萜-3β-醇低濃度組無羈萜-3β-醇中濃度組無羈萜-3β-醇高濃度組F NPY 395.34±21.74 586.76±56.55a414.64±23.65ab534.65±35.59abc494.35±29.69abc422.77±32.78abc34.433＊＊β-EP 378.14±28.78 175.98±16.66a329.76±30.54ab197.48±21.64abc245.56±32.56abc346.29±33.77abc32.256＊＊

2.4 腦組織 TGF-β、MMP-2、NOS、CD3含量檢測 與正常對照組比較，AE模型組豚鼠腦組織TGF-β降低，MMP-2、NOS、CD3升高；醋酸潑尼松與無羈萜-3β-醇可明顯抑制豚鼠腦組織TGF-β降低和MMP-2、NOS、CD3升高，見表4。

2.5 神經元形態 （1）光鏡下：AE豚鼠大腦皮質神經元腫脹，并有炎細胞浸潤，部分神經元胞體變小或呈三角形，基質疏松伴明顯微空泡形成；醋酸潑尼松與無羈萜-3β-醇明顯抑制神經元凋亡現象，見圖1。（2）電鏡下：AE豚鼠大腦皮質神經元皺縮、膜結構不清；胞核固縮，染色質聚集成團、異染色質增多，高爾基體增多，線粒體腫脹，嵴融合并出現空泡變性。醋酸潑尼松與無羈萜-3β-醇明顯抑制神經元凋亡現象，見圖2。

2.6 NOS在神經元內表達 AE豚鼠大腦皮質神經元胞質內熒光高表達，醋酸潑尼松與無羈萜-3β-醇明顯抑制AE豚鼠大腦皮質神經元胞質內熒光表達，見圖3。

Tab.4 Comparison of the TGF-β,MMP-2,NOS,CD3 content in brain tissue among five groups表4 各組腦組織TGF-β、MMP-2、NOS、CD3含量比較 （n=6，ng∕L,±s）

Tab.4 Comparison of the TGF-β,MMP-2,NOS,CD3 content in brain tissue among five groups表4 各組腦組織TGF-β、MMP-2、NOS、CD3含量比較 （n=6，ng∕L,±s）

組別正常對照組AE模型組醋酸潑尼松組無羈萜-3β-醇低濃度組無羈萜-3β-醇中濃度組無羈萜-3β-醇高濃度組F TGF-β 20.45±3.33 12.43±0.69a17.56±0.87ab14.32±0.74abc15.84±0.46abc16.75±0.56a bc38.865＊＊MMP-2 6.55±1.46 32.76±2.66a7.86±1.47ab25.65±4.88abc15.77±3.97abc11.87±1.77abc34.342＊＊組別正常對照組AE模型組醋酸潑尼松組無羈萜-3β-醇低濃度組無羈萜-3β-醇中濃度組無羈萜-3β-醇高濃度組F NOS 13.65±1.23 36.63±4.05a16.76±2.34ab34.57±4.68abc22.87±3.45abc16.67±1.97abc31.433＊CD312.54±1.29 36.42±5.45a14.44±1.76ab34.84±2.93abc25.74±2.67abc14.55±1.87abc33.643＊＊

3 討論

3.1 AE的常規藥物治療及缺點 AE在兒童中的發病概率較高，患者常出現神經功能進行性障礙、肌肉無力、肢體癱瘓等癥狀。糖皮質激素具有抑制免疫應答、抗炎、抗病毒、抗休克作用，是目前治療AE的常用藥物[5]。但是，長期使用腎上腺皮質激素可引起皮質功能亢進、糖尿病、骨質疏松、感染加重等不良反應。因此，臨床上在使用糖皮質激素緩沖治療的同時，往往聯合使用ATP、輔酶A、腺苷、胞二磷膽堿等藥物，以促進神經功能的恢復。此外，少量多次輸注健康人新鮮血漿也有助于提高患者的免疫功能，有益于預防AE感染和恢復。

3.2 無羈萜-3β-醇的抗AE作用 有學者報道，無羈萜-3β-醇具有一定的抗氧化[2]、抗炎、抗免疫作用[3]，而AE是由CD4+T淋巴細胞介導的慢性變態反應性疾病，因此，本研究選用醋酸潑尼松作對照藥物，醋酸潑尼松具有上調抗炎細胞因子以及抑制促炎細胞因子表達的作用。本研究顯示，100 mg∕（kg·d）無羈萜-3β-醇抑制AE的作用與2 mg∕（kg·d）醋酸潑尼松效果接近。

AE是由CD4+T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病[6]，阻斷或抑制CD4+T淋巴細胞能夠有效防治AE發生[7]。研究表明，在AE的緩解期CD4+∕CD8+比值呈明顯下降趨勢，CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞以及CD4+∕CD8+比值可作為AE發展狀態及評定藥物療效的重要指標[8]。本研究顯示，無羈萜-3β-醇抑制AE豚鼠外周血CD4+升高、CD8+降低、CD4+∕CD8+升高。

阿片受體β-EP在免疫應答過程中起到免疫抑制的作用[9-10]。本研究結果顯示，無羈萜-3β-醇抑制外周血神經遞質NPY含量升高、β-EP含量降低。MMP-2直接攻擊血管基底膜，引起炎細胞浸潤。CD3僅存在于T細胞表面，參與T細胞的信號轉導。本研究結果顯示，無羈萜-3β-醇抑制豚鼠腦組織TGF-β降低和MMP-2、NOS、CD3升高。

此外，形態學觀察發現，AE豚鼠大腦皮質神經元凋亡明顯，無羈萜-3β-醇明顯抑制神經元凋亡現象。TGF-β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用。

3.3 NO信號通路的影響 NOS參與調節NO生成，NO是先天性免疫應答的調節性效應分子，作為一種信息傳遞物質維持正常的生理功能[11-13]。本研究通過免疫熒光發現，NOS在AE豚鼠大腦皮質神經元胞質內熒光高表達，2 mg∕（kg·d）的醋酸潑尼松與100 mg∕（kg·d）-1的無羈萜-3β-醇明顯抑制AE豚鼠大腦皮質神經元胞質內NOS熒光表達。因此，無羈萜-3β-醇有可能通過影響NO信號通路對AE產生作用，其具體的藥物作用機制有待進一步研究。

Fig.1 Light microscope image of guinea pig brain neurons圖1 豚鼠大腦神經元光鏡圖像（HE×400）

Fig.2 Electron microscopy image of guinea pig brain neurons圖2 豚鼠大腦神經元電鏡圖像（×12 000）

Fig.3 NOS expression in the neuronal cytoplasm圖3 免疫熒光顯微鏡下觀察NOS在神經元胞質內的表達（×400）

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（2014-01-29收稿 2014-05-21修回）

（本文編輯 李鵬）

Inhibition Effect of Non Custodial Terpenes-3 β-Alcohol to Autoimmune Encephalomyelitis

GUO Xixia1，YANG Jing2，HUANG Ning1，WAN Renling1，LI Zhaohui1，XU Gaowei1，YIN Yaling1△,LI Peng1
1 Xinxiang Medical University，Henan 453003，China；2 Puyang medical school，Henan△

E-mail:hnxxlp@163.com

ObjectiveTo study the inhibition effect of non custodial terpenes-3 β-alcohol to experimentally induced autoimmune encephalomyelitis in guinea pigs.MethodsDifferent doses(25 mg∕kg,50 mg∕kg and 100 mg∕kg)of non custodial terpenes-3 β-alcohol were given to the experimentally induced autoimmune encephalomyelitis model of guinea pigs by gavage for 8 weeks.Plasma levels of CD4+∕CD8+,IL-1,IL-2,IL-6,IL-10,neuropeptide Y(NPY),beta endorphin(β-EP),transforming growth factor-β(TGF-β),matrix metalloproteinase(MMP-2),nitric oxide synthase(NOS)and leukocyte differentiation antigen CD3were assessed.The brain neuron morphology changes was observed under light microscopy while its ultrastructure changes was observed under electron microscope.NOS expression in neurons was observed through immunofluoresce technology.ResultsNon custodialterpenes-3β-alcohol inhibited the increase of plasma CD4+∕CD8+,IL-1,IL-2,IL-6,IL-10,MMP-2,CD3and NPY while decrease of plasma β-EP,brain TGF-β.It also increase NOS expression in neuronal cytoplasm and maintained neuron morphology.ConclusionNon custodial terpenes-3 β-alcohol inhibited the experimental autoimmune encephalomyelitis in guinea pig.

encephalomyelitis,autoimmune,experimental；interleukins；receptors,cytokine；neuropeptide Y；transforming growth factor beta；matrix metalloproteinase 2；nitric oxide synthase；antigens,CD；neurons；non custodial terpenes-3 β-alcohol

R744.3

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.002

國家自然科學基金資助項目（81200836）；河南省科技廳科技攻關項目（132102310247）；新鄉醫學院重點研究領域招標課題（ZD2011-30）

1新鄉醫學院（郵編453003）；2濮陽市衛生學校

△通訊作者 E-mail：hnxxlp@163.com