MCP-1轉染人臍靜脈內皮細胞過表達/沉默后相關信號通路研究

宋 恩 李光第 周如丹 趙學凌

細胞與分子生物學

MCP-1轉染人臍靜脈內皮細胞過表達/沉默后相關信號通路研究

宋 恩 李光第 周如丹 趙學凌△

目的 探討單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）轉染人臍靜脈內皮細胞過表達/沉默后相關信號通路與深靜脈血栓形成的關系。方法培養人臍靜脈內皮細胞行免疫熒光、免疫共沉淀檢測，構建人MCP-1細胞系過表達/沉默載體，基因表達譜芯片檢測人MCP-1細胞系過表達/沉默后轉錄譜變化并行生物信息技術分析。結果培養人臍靜脈內皮細胞；構建人MCP-1過表達/干擾載體MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1經病毒轉染后感染HUVECs；基因芯片檢測發現與正常細胞相比，過表達載體MCP-1-pCDH-GFP轉染細胞有18條信號通路下調，7條信號通路上調；干擾載體MCP-1-LMP shRNAmir1轉染細胞有60條信號通路下調，15條信號通路上調。結論MCP-1轉染人臍靜脈內皮細胞后相關信號通路為深靜脈血栓疾病分子層面研究提供新的思路，MCP-1可能在深靜脈血栓形成發生發展過程中發揮重要作用。

單核細胞；趨化因子類；內皮，血管；臍靜脈；信號傳導；靜脈血栓形成；單核細胞趨化蛋白-1；人臍靜脈內皮細胞

單核細胞趨化蛋白（MCP）屬于趨化因子家族CC亞族成員，該亞族主要由活化T細胞產生。MCP包括MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5[1]。MCP-l主要由內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等分泌與釋放。MCP-1具有誘導單核巨噬細胞趨化和激活單核巨噬細胞的雙重作用[2]。MCP-l是炎癥反應的始動因子，通過誘導、調節其他炎性介質的產生和釋放，形成級聯反應，介導炎癥反應的進展。MCP-1參與動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病炎癥反應過程[3]。深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）是一種血液在深靜脈內異常凝結導致的靜脈回流障礙性疾病，DVT的病理生理過程包括血管壁損傷、血流淤滯、血液高凝狀態、炎癥反應等，其中炎癥反應對DVT的發生發展起到重要作用[4]。目前已有研究表明，在DVT形成過程中，MCP-1協同白細胞介素（IL）-6等炎性因子也發揮重要作用[5]。本實驗針對MCP-1在細胞層面進行研究，通過生物信息學分析，探索其相關信號通路的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 過表達慢病毒載體及shRNA逆轉錄病毒載體購于Ambion公司；轉染試劑購于QIAGEN公司；TRIzol、熒光定量引物、二抗IgG-HRP購于Invitrogen公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于Fermentas公司；瓊脂糖凝膠電泳檢測購于OMEGA公司；PVDF膜購于Millipore公司；一抗購于Santan和康為公司；Real-time PCR用96孔板及膜、ECL顯色試劑盒購于Bio-Rad公司；離心管、槍尖、PCR管購于Axygen公司；X線片購于柯達公司；HUVECs細胞原代及傳代培養耗材購于Corning公司。

1.2 臍靜脈內皮細胞培養，免疫熒光及免疫共沉淀檢測 原代人臍靜脈內皮細胞培養，制作細胞爬片，分別以抗人MCP-1抗體孵育，FITC標記二抗與之結合，激光共聚焦拍照觀察蛋白在細胞中的定位，設置3次平行實驗。培養人血管內皮細胞，收集、裂解細胞，以抗人MCP-1抗體進行IP反應，在反應中加入Protein A+G Agarose吸附MCP-1抗體，離心收集磁珠/抗體/蛋白復合物，將復合物進行SDS-PAGE分析，以銀染顯色，分離的條帶挖膠進行質譜分析。

1.3 人MCP-1基因慢病毒過表達載體構建 通過GenBank數據庫搜索人MCP-1基因完整CDS序列，用BLAST分析尋找特異性設計引物，引物設計軟件為primer 5.0，上游5′-GCAAGCTTATGCCTTGTGTTCAGGCG-3′，下游5′-GCCTCGAGTTAGAAAGGTAAGGTGTC-3′，產物長度300 bp。行PCR反應，條件如下：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30次循環，72℃延伸10 min。對人MCP-1基因進行擴增，退火溫度為58℃，通過進行膠回收行瓊脂糖凝膠電泳檢測；將收集膠回收的目的片段和質粒載體進行連接，以pCDH-GFP為測序引物進行測序。

1.4 人MCP-1基因逆轉錄病毒干擾載體構建 人MCP-1基因逆轉錄病毒Oligo片段擴增，利用Oligoengine在線軟件設計2條22個堿基的候選siRNA靶序列。miR30FWD(Xho Ⅰ)：5′-CAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGT-3′，miR30REV(EcoRⅠ)：5′-CTAAAGTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA-3′，篩選出G+C含量小于50％，且與哺乳動物的其他基因沒有同源性的最優siRNA靶序列，再根據MSCV-LMP逆轉錄病毒載體的特點，設計出相應的具有發夾結構的shRNA模板。將合成的Oligo片段稀釋后，退火溫度52℃，條件如下：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30次循環，72℃延伸10 min。進行PCR反應。干擾片段擴增后，行瓊脂糖凝膠電泳檢測。把膠回收的目的片段和質粒載體進行連接，以LMP為測序引物進行測序。

1.5 過表達/干擾載體病毒包裝、感染 病毒宿主細胞為293T細胞，HUVECs為感染細胞。pCDH-GFP(12 μg)的包裝質粒為pCL-ECO，用量8 μg；轉染人MCP-1-pCDH-GFP過表達質粒，MSCV-LMP(12.5 μg)包裝質粒分別是：pAPAX(7.5 μg)、pMD2.G(5 μg)；分別轉染人MCP-1-LMP shRNAmir1、2質粒，總時間感染48～72 h后，為檢測所構建干擾載體是否能有效上調和下調目的基因表達，將構建質粒分組轉染細胞。檢測MCP-1 mRNA實驗部分分為過表達實驗及干擾實驗，在過表達實驗中設置：正常組（正常細胞）、空白組（轉染空載體細胞）、過表達組；在干擾實驗中設置：正常組（正常細胞）、空白組（轉染空載體細胞）、干擾1組、干擾2組。檢測MCP-1蛋白水平實驗中，設置：正常組（正常細胞）、過表達組、干擾1組、干擾2組。

1.6 Real-time PCR測定人MCP-1 mRNA水平 TRIzol抽提細胞總RNA；依據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒標準操作進行cDNA合成。SYBR熒光定量PCR引物設計，引物設計軟件為primer 5.0，人MCP-1上游引物5′-CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGATT-3′，下游引物5′-TCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC-3′，產物長度89 bp。βactin上游引物5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′，產物長度180 bp。Real-time反應兩步法條件如下：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火/延伸60 s，共40次循環。實驗依據Maxima?SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)（Fermentas）操作。結果的參數主要是觀察熔解曲線和擴增曲線，用軟件DataAssist?v3.0 Software（ABI）以2-ΔΔCt方法來對結果進行分析。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.7 人MCP-1蛋白水平測定 實驗細胞總蛋白提取：收集各組HUVECs后添加Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF) （Sigma）的RIPA裂解液（Beyotime），冰浴30 min；4℃12 000 r/min離心5 min；取上清，再用BCA法測定計算蛋白濃度。蛋白免疫印跡法（Western Blot）分析目標蛋白的表達情況：將電泳分離后的細胞總蛋白質從凝膠轉移到固相支持物PVDF膜上，然后以特異性抗體(一抗MCP-1/β-actin，兔抗人，1∶1 000)檢測目標蛋白的表達情況，Bio-Rad膜成像系統下顯色成像并用Quantity One軟件對比分析。

1.8 人MCP-1細胞系過表達/沉默后轉錄譜變化 按前文轉染步驟進行實驗，將收獲轉染了人的MCP-1-LMP shRNAmir1、MCP-1-pCDH-GFP過表達的細胞和轉染空載體細胞作為對照，提取總RNA，分組為（1）正常組細胞。（2）MCP-1-pCDH-GFP轉染細胞。（3）MCP-1-LMP shRNAmir1轉染細胞。進行基因表達譜芯片分析，每樣品1張芯片，共3個基因芯片；樣本送至上海康成生物工程有限公司進行基因芯片檢測。

1.9 統計學方法 統計學分析采用SPSS 19.0統計軟件完成。計量資料采用均數±標準差（±s）表示；比較組間數據采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用Tukey及Scheffe法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人MCP-1基因慢病毒過表達載體、逆轉錄病毒干擾載體構建 慢病毒過表達載體構建，PCR擴增人MCP-1目的基因，瓊脂糖電泳清晰可見單一的目的條帶；本研究選取慢病毒載體pCDH-GFP中，EcoRⅠ和BamHⅠ兩個酶切位點來連接載體與目的基因，見圖1。依據逆轉錄病毒載體LMP質粒載體特點，固定選取XhoⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點來進行連接，構建逆轉錄病毒干擾載體。擴增人MCP-1-LMP shRNAmir1、2干擾載體，條帶在 985 bp/ 7 019 bp表明已插入目的條帶，屬于陽性克隆。每個載體挑取2個克隆，進行初步的酶切鑒定，見圖2。

Fig.1 Electrophoresis result of human MCP-1 PCR products and pCDH-GFP plasmid profile圖1 人MCP-1PCR產物電泳檢測及pCDH-GFP質粒圖譜

Fig.2 H MCP-1 carrier enzyme identification and LMP lentiviral vector圖2 載體酶切鑒定圖譜及慢病毒載體LMP質粒圖譜

2.2 過表達及抑制效率檢測 檢測MCP-1 mRNA過表達實驗中，過表達組（5.365±0.752）較正常組（1.007±0.276）及空白組（1.223±0.426）mRNA表達明顯上調（F=65.895，P＜0.05），正常組及空白組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。檢測MCP-1 mRNA干擾實驗中，干擾1組mRNA表達（0.052±0.019）較正常組（1.004±0.161）、空白組（0.998±0.206）及干擾2組（0.968±0.306）表達明顯下調（F=16.169，P＜0.05）。檢測MCP-1蛋白水平實驗中，正常組、過表達組及干擾1、2組Ratio值分別為：0.62、0.84、0.24、0.56，過表達組蛋白水平較正常組明顯上調，干擾1組較正常組及干擾2組明顯下調，見圖3。

Fig.3 Results of Western blot analysis for protein expressions of human MCP-1圖3 Western blot檢測人MCP-1蛋白表達水平結果

2.3 人MCP-1細胞系過表達/沉默后轉錄譜的變化 MCP-1-pCDH-GFP過表達載體、MCP-1-LMP shRNAmir1干擾載體進行細胞轉染，收獲正常組細胞（轉染空載體細胞）；MCP-1-pCDH-GFP轉染細胞；MCP-1-LMP shRNAmir1轉染細胞，行基因芯片檢測，基因芯片檢測到的所有表達變化的基因熱譜圖，其中紅色表示相對高表達，綠色代表相對低表達，見圖4。基因芯片檢測結果根據KEGG Pathway分析可見，與正常細胞相比，過表達載體MCP-1-pCDH-GFP轉染細胞有18條信號通路下調，7條信號通路上調；干擾載體MCP-1-LMP shRNAmir1轉染細胞有60條信號通路下調，15條信號通路上調，見圖5～8。

Fig.4 Gene chip thermography圖4 基因芯片熱譜圖

Fig.5 Compared with normal group,MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells showed 18 down-expressed signaling pathways圖5 與正常細胞相比MCP-1-pCDH-GFP轉染細胞18條信號通路下調

Fig.6 Compared with normal group,MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells showed 7 up-expressed signaling pathways圖6 與正常細胞相比MCP-1-pCDH-GFP轉染細胞7條信號通路上調

Fig.7 Compared with normal group,MCP-1-LMP shRNAmir1-transfected cells showed 60 down-expressed signaling pathways圖7 與正常細胞相比MCP-1-LMP shRNAmir1轉染細胞60條信號通路下調

Fig.8 Compared with normal group,MCP-1-LMP shRNAmir1-transfected cells showed 15 up-expressed signaling pathways圖8 與正常細胞相比MCP-1-LMP shRNAmir1轉染細胞15條信號通路上調

3 討論

靜脈血栓栓塞(VTE)是一種多原因引起的，多基因相關的疾病，包括DVT和肺動脈栓塞(PE)。在西方國家DVT和PE的發病率分別約為0.93％和0.05％，外科手術后行抗凝治療的患者，DVT的發生率為9.6％[6]。19世紀，Virchow提出靜脈血栓形成的三聯病因：靜脈壁損傷、血流滯緩和血液高凝狀態的致栓學說，但內涵已從早期的病理解剖深化到現代的分子水平機制研究[7]。根據現階段對DVT形成機制的研究，參與DVT形成的關鍵角色有：血管內皮細胞、血小板、膠原、炎性因子、血流動力學等，各因素間彼此相互影響，導致靜脈內環境中凝血/抗凝、纖溶/抗纖溶系統的動態平衡打破，最終導致血栓形成[8]。但現階段只了解DVT部分形成機制，近年來隨著對血栓疾病不斷深入研究，尚有很多未被發現的因素直接或間接地影響血栓形成的關鍵環節，調控血栓形成。而針對DVT形成的分子機制，已發現有大量的基因、蛋白在血栓形成過程中起到重要作用，并且部分在動脈血栓等心血管疾病中得到證實[9-10]。

趨化因子的重要成員MCP-1是一種堿性蛋白，為76個氨基酸殘基構成的蛋白單鏈。MCP-1的受體 CC趨化因子受體 2(CC chemokine receptor 2，CCR2)是一類含有7個跨膜區的G蛋白偶聯受體，位于3號染色體上，在各種細胞類型上都有發現，包括嗜堿性粒細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和T細胞。MCP-1與CCR2結合后，受體變構并與G蛋白結合，激活磷酸肌醇等信號轉導通路發揮生物學作用[11]。目前在心血管疾病中MCP-1的研究較廣泛。Park等[12]也發現在急性心肌梗死的早期階段，形成良好側支循環的患者比沒有形成側支循環的患者血漿中MCP-I的水平明顯增加，表明MCP-l的過度表達在急性心肌梗死的早期階段對側支循環的形成有重要意義，可能為早期急性心肌梗死的治療提供新的途徑。宋軍鋒等[13]研究發現，急性冠脈綜合征患者的MCP-1水平較穩定型心絞痛和正常對照組患者增高，證實MCP-l是動脈粥樣硬化和斑塊不穩定的指標，且MCP-l水平與冠脈側支形成呈正相關。許政等[14]構建兔右頸總動脈瘤模型，研究發現在模型腦動脈瘤壁中有大量的MCP-1的表達，表達細胞主要為平滑肌細胞和血管內皮細胞，提示動脈瘤壁的組成細胞能不斷產生趨化因子，趨化單核細胞，加強炎性反應。提示了在腦動脈瘤發病過程中，MCP-1基因作為早期表達基因，其表達產物誘導了單核巨噬細胞在動脈壁的黏附，進一步使動脈壁彈力纖維降解，促進了腦動脈瘤的發生、發展。現已證明，動脈粥樣硬化(Atheroselerosis，As)是一種慢性炎癥性疾病，細胞因子在As的各個階段中發揮著重要的調節作用，MCP-l是與As具有密切關系的細胞因子之一[14]。Kawanami等[15]發現Rho-kinase可激活凝血酶，通過p38MAPK/NF-κB信號通路，使MCP-l表達上調。Lin等[16]發現MCP-l對單核細胞與血管內皮細胞黏附方面起到重要作用。但目前MCP-l在DVT形成過程中的具體機制尚未闡明。

本實驗通過培養人臍靜脈內皮細胞，構建人MCP-1過表達/干擾載體MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1經病毒轉染后感染HUVECs，應用基因芯片檢測發現與正常細胞相比，過表達載體MCP-1-pCDH-GFP轉染細胞有18條信號通路下調，7條信號通路上調；干擾載體MCP-1-LMP shRNAmir1轉染細胞有60條信號通路下調，15條信號通路上調。

隨著對MCP-1的生物學功能、基因定位和調節信號轉導機制及相關信號通路的進一步認識，以及它對其他細胞因子和炎性細胞的調控的深入研究，探索如何對其中的某些環節進行干預，將為DVT分子機制的研究提供新思路。

[1] Hashizume M,Mihara M.Blockade of IL-6 and TNF-a inhibited oxLDL-induced production of MCP-1 via scavenger receptor induction[J].Eur J Pharmacol,2012,689(1-3):249-254.doi:10.1016/j. ejphar.2012.05.035.

[2] Koo TY,Kim YJ,Yang WS,et al.Mycophenolic acid regulates spleen tyrosine kinase to repress tumour necrosis factor-alpha-induced monocyte chemotatic protein-1 production in cultured human aortic endothelial cells[J].Cell Biol Int,2013,37(1):19-28.doi: 10.1002/cbin.10003.

[3]Younce CW,Kolattukudy PE.MCP-1 causes cardiomyoblast death via autophagy resulting from ER stress caused by oxidative stress generated by inducing a novel zincnger protein,MCPIP[J].Biochem J,2010,426(1):43-53.doi:10.1042/BJ20090976.

[4]Bouman AC,Smits JJ,Ten Cate H,et al.Markers of coagulation,fibrinolysis and inflammation in relation to post-thrombotic syndrome [J].J Thromb Haemost，2012,10:1532-1538.doi:10.1111/j.1538-7836.2012.04798.x.

[5] Hassanian SM,Dinarvnd P.Adenosine regulates the proinflammatory signaling function of thrombin in endothelial cells[J].Cell Physiol,2014,229:1292-1300.doi:10.1002/jcp.24568.

[6] Pabinger-Fasching I,Eichinger-Hasenauer S,Grohs J,et al.Prevention of venous thromboembolism in musculoskeletal surgery[J]. Wien Klin Wochenschr,2014,126(9-10):298-310.doi:10.1007/ s00508-014-0509-5.

[7]Huisman MV,Klok FA.Diagnostic management of acute deep vein thrombosis and pulmonary embolism[J].J Thromb Haemost,2013,11 (3):412-422.doi:10.1111/jth.12124.

[8]Keeling D,Alikhan R.Management of venous thromboembolism–controversies and the future[J].Br J Haematol,2013,161(6):755-763.doi:10.1111/bjh.12306.

[9]Rodriguez AL,Wojcik BM,Wrobleski SK,et al.Statins,inflammation and deep vein thrombosis:a systematic review[J].J Thromb Thrombolysis,2012,33(4):371-382.doi:10.1007/s11239-012-0687-9.

[10]Bouman AC,Cheung YW,Spronk HM,et al.Biomarkers for post thrombotic syndrome:A case-control study[J].Thromb Res,2014, 134(2):369-375.doi:10.1016/j.thromres.2014.06.010.

[11]Matos MF,Louren?o DM,Orikaza CM,et al.The role of IL-6,IL-8 and MCP-1 and their promoter polymorphisms IL-6-174GC,IL-8-251AT and MCP-1-2518AG in the risk of venous thromboembolism:A case-control study[J].Thromb Res,2011,128(3):216-220.doi:10.1016/j.thromres.2011.04.016.

[12]Park HJ,Chang K,Park CS,et al.Coronary collaterals:The role of MCP-I during the early phase of acute myocardial infraction[J].Int Cardiol,2008,130(3):409-413.doi:10.1016/j.ijcard.2007.08.128.

[13]Song JF,Cheng XP,Li RQ,et al.Correlation study on serum monocyte chemoattractant protein-I levels and coronary collateral circulation in patients with acute coronary syndrome[J].National Medical Frontiers of China,2011,6(21)：1-2.[宋軍鋒,陳小平,李潤琴,等. MCP-1與急性冠脈綜合征患者冠狀動脈側支循環的相關性研究[J].中國醫療前沿,2011,6（21）：1-2.]doi:10.3969/j.issn.1673-5552.2011.21.0001.

[14]Xu Z,Zhang SM,Jiao L,et al.The effects of the expression of NF-κB,MCP-1 and MMP-9 on experimental cerebral aneurysm rabbit model[J].Chin J Neurosurg,2011,27(6):630-634.[許政,張世明,焦磊，等.NF-κB激活及MCP-1和MMP-9表達在兔頸總動脈瘤中的作用[J].中華神經外科雜志,2011,27(6):630-634.]doi: 10.3760/cma.j.issn.1001-2346.2011.06.031.

[15]Kawanami D,Matoba K,Kanazawa Y,et al.Thrombin induces MCP-1 expression through Rho-kinase and subsequent p38MAPK/ NF-kB signaling pathway activation in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2011,411(12):798-803.doi: 10.1016/j.bbrc.2011.07.031.

[16]Lin Y,Zhen Y,Liu J,et al.Rhein lysinate inhibits monocyte adhesion to human umbilical vein endothelial cells by blocking p38 signaling pathway[J].Arch Pharm Res，2013,36(11):1410-1418.doi: 10.1007/s12272-013-0156-9.

（2014-05-26收稿 2014-08-07修回）

（本文編輯 魏杰）

The Study of Signaling Pathways in MCP-1 Over-Expression/Interference of HUVECs

SONG En,LI Guangdi,ZHOU Rudan,ZHAO Xueling△
Orthopedics Department of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China△

E-mail:zxldoctor@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the association between the signaling pathways of MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells and deep venous thrombosis(DVT).MethodsThe cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were tested by immunofluorescence and co-immunoprecipitation methods.The constructed MCP-1 over-expression/interference vector,and the change of transcription profile were detected by microarray assay and biological information technology analysis.ResultsMCP-1 over-expression/interference vector MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1 was constructed and HUVECs were transfected.According to the microarray analysis we found that there were 18 down-expressed signaling pathways and 7 up-expressed signaling pathways in MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells.There were 60 downexpressed signaling pathways and 15 up-expressed signaling pathways in the MCP-1-LMP shRNAmir1 transfected cells.ConclusionSignaling pathways of MCP-1 plays an important role in DVT formation，which may provide us a new way to study molecular mechanism of DVT.

monocytes;chemotactic factors;endothelium,vascular;umbilical veins;signal transduction;venous thrombosis;monocyte chemoattractant protein-1;human umbilical vein endothelial cells

R543

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.001

國家自然科學基金資助項目（801060151）；云南省衛生科技計劃項目（2012ws0007）；云南省科技廳重點新產品開發計劃項目（2010BC010）

昆明醫科大學第一附屬醫院骨科（郵編650032）

△通訊作者 E-mail:zxldoctor@hotmail.com