2型糖尿病大鼠腦組織EGFL-7的表達及氨基胍和Baicalein對其干預作用

王 瓊 李惠勉

2型糖尿病大鼠腦組織EGFL-7的表達及氨基胍和Baicalein對其干預作用

王 瓊 李惠勉△

目的 研究人表皮生長因子樣結構域蛋白-7（EGFL-7）因子在2型糖尿病大鼠腦組織中的表達以及氨基胍、Baicalein干預后對其影響。方法48只SD大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組4組，每組12只。正常對照組給予普通飲食喂養；糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組采用高脂高糖飲食聯合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素的方法建立糖尿病大鼠模型。造模成功后，氨基胍組、Baicalein組分別給予氨基胍溶液、Baicalein溶液灌胃，劑量均為150 mg/（kg·d），正常對照組、糖尿病組給予等量生理鹽水灌胃。16周后，用免疫組織化學法及蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測各組大鼠腦組織EGFL-7的表達。結果免疫組織化學法及蛋白免疫印跡法均顯示，與正常對照組比較，糖尿病組、氨基胍組及Baicalein組EGFL-7的表達均明顯增加（P＜0.01），與糖尿病組比較，氨基胍組、Baicalein組EGFL7表達明顯降低（P＜0.01），Baicalein組與氨基胍組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論EGFL-7可能參與糖尿病大鼠腦血管增生與重塑，氨基胍、Baicalein在一定程度上抑制其血管增生，其抑制作用可能是通過降低EGFL-7表達來實現的。

糖尿病,2型；人表皮生長因子樣結構域蛋白-7；氨基胍；Baicalein；血管增生；血管重塑

人表皮生長因子樣結構域蛋白-7（epidermal growth factor-like domain-7，EGFL-7）是最新發現的內皮細胞特異性分泌因子，在血管管腔形成中具有重要的作用。近年來發現EGFL-7在斑馬魚[1]、鼠[2]及人[3]的胚胎及動脈血管內皮細胞高水平表達，而在糖尿病所引起的腦血管損傷中表達尚不清楚。本實驗通過觀察該因子在腦血管中表達情況，并應用氨基胍及Baicalein 2種藥物進行干預，探討其對糖尿病大鼠腦組織的可能影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 8～9周齡SD大鼠48只，體質量180～200 g（鄭州大學實驗動物中心提供），鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）和氨基胍（美國sigma公司），Baicalein（上海楷洋生物技術有限公司），One-Touch-Ⅱ型血糖儀及試紙（美國強生公司），兔抗人EGFL-7多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；免疫組化試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉生物工程公司），Western二抗（Jackson ImmunoResearch公司），內參β-actin一抗（美國GenView公司），ECL化學發光試劑盒（PIERCE）。

1.2 動物模型的制備和分組 48只SD大鼠應用隨機數字表法分為正常對照組、糖尿病組、氨基胍組和Baicalein組，每組12只，正常對照組給予普通飲食喂養；其余3組按照文獻[4]的方法建立糖尿病大鼠模型，即先分別給予高脂高糖飲食（10.0％豬油、20.0％蔗糖、2.5％膽固醇、1％膽鹽、66.5％普通飼料）喂養，喂養6周后，糖尿病組、氨基胍組及Baicalein組大鼠禁食不禁水12 h，于左下腹部腹腔注射30 mg/kg STZ溶液（臨用前用0.1 mmol/L，pH 4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成2％的溶液，避光進行，現配現用），正常對照組腹腔注射等體積的枸櫞酸鈉緩沖液，72 h后尾靜脈采血，用One-Touth血糖儀測定血糖，以隨機非空腹血糖＞16.7 mmol/L定為糖尿病模型，造模成功后，氨基胍組、Baicalein組分別給予氨基胍溶液、Baicalein溶液灌胃，劑量均為150 mg/（kg·d），正常對照組、糖尿病組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均飼養16周，檢測血糖、觀察病情。

1.3 免疫組化法檢測大鼠腦組織EGFL-7的表達 16周末，各組大鼠用10％水合氯醛（250 mg/kg）腹腔注射麻醉，開胸，用穿刺針小心插入左心室，同時剪開右心耳，生理鹽水10 mL經心臟快速灌注，直至流出液體變清，再灌注4％多聚甲醛約250 mL，直到大鼠全身僵硬為止，開顱取出全腦，去掉腦干和小腦，4％多聚甲醛固定8 h，常規石蠟包埋切片，PBS沖洗3次，浸泡5 min/次，室溫滴加3％H2O220 min，PBS沖洗3次，5 min/次，SP試劑盒說明書進行操作，一抗（EGFL-7，1∶100）二甲苯聯苯胺（DAB）顯色，鏡下控制顯色時間，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。EGFL-7的陽性計數表達采用在高倍鏡（×400）下隨機讀取10個不重復視野，對染成淺棕色至深棕色血管數進行統計，取平均值。

1.4 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測大鼠腦EGFL-7蛋白的表達 于16周末各組大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取腦，生理鹽水沖洗，迅速置于液氮罐低溫保存。從液氮罐中取出全腦，置于勻漿器中，按照每100 mg組織加入1 000 μL裂解液（RIPA）于冰上勻漿，4℃離心10 min；輕輕吸取上清，移至新的離心管中，-80℃保存備用。根據蛋白定量調整蛋白上樣量，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度12％，分離膠濃度5％，電壓分別為濃縮膠80 V、分離膠120 V，半干轉至PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉液封閉1 h，加入EGFL-7一抗，4℃孵育過夜，濃度為1∶500，用TBST搖床洗膜3次，每次5 min；加二抗，濃度1∶4 000，室溫孵育2 h，同上洗滌，分別滴加內參一抗、二抗，ECL顯色，X線片壓片沖洗，掃描膠片上的條帶，以目的蛋白灰度值與內參灰度值比值進行統計分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件包進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組織化學結果 EGFL-7的陽性表達為淺棕色至深棕色顆粒或呈條索狀，主要表達于血管內皮上，見圖1。與正常對照組相比，糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組EGFL-7表達明顯增加（P＜0.01）,與糖尿病組相比，氨基胍組、Baicalein組EGFL-7的表達明顯減少（P＜0.01）；氨基胍組與Baicalein組表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Expressions of EGFL-7 and the gray value of EGFL-7 in brain tissue in four groups表1 各組大鼠腦組織EGFL-7表達的陽性細胞數及相對灰度值 （±s）

Tab.1 Expressions of EGFL-7 and the gray value of EGFL-7 in brain tissue in four groups表1 各組大鼠腦組織EGFL-7表達的陽性細胞數及相對灰度值 （±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與糖尿病組比較，P＜0.01

相對灰度值（％）25.03±2.44 57.39±4.21a36.38±2.57ab33.45±5.22ab110.758＊＊組別正常對照組糖尿病組氨基胍組Baicalein組F n 12 12 12 12陽性細胞數0.39±0.69 18.80±2.62a14.10±1.97ab13.80±2.10ab15.598＊＊

2.2 Western blotting結果 與正常對照組比較，糖尿病組、氨基胍組、Baicalein組EGFL-7表達均明顯增多（P＜0.01），與糖尿病組比較，氨基胍組、Baicalein組EGFL-7表達明顯降低（P＜0.01），Baicalein組與氨基胍組比較，EGFL-7的表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2，表1。

3 討論

3.1 EGFL-7基因和蛋白結構 EGFL-7又被稱為血管內皮抑制素（VE-statin），是一個分子質量為30 ku的蛋白，其在物種中的表達高度保守。EGFL-7轉錄起始點位于上游5.4 kb啟動子片段，包含了2個保守位點組成，被稱為Ets結合位點。在胚胎和成年組織的轉基因小鼠，Ets轉錄因子結合位點是運載EGFL-7使其表達在內皮基因上的重要的結合位點[5]。EGFL-7啟動子還包含1個GATA-2共識結合位點[6]，這兩種結合位點使得EGFL-7對血液和血管內皮早期發育起到了重要作用。

3.2 EGFL-7與血管內皮重塑 目前研究發現，EGFL-7在促進血管內皮細胞的增殖、遷移、發芽以及浸潤方面有重要的作用，并且與血管外基質的重塑相關[7]，如腫瘤血管的生成，炎癥組織及動脈粥樣硬化斑塊等[8-9]。而在正常成熟組織中表達較低，說明EGFL-7表達的升高與血管生成有關。在De Mazière等[1]研究斑馬魚實驗中消除了EGFL-7因子后，血管面積大量減少。在Schmidt等[2]研究也同樣證實，敲除了EGFL-7的純合子小鼠顯示出異常狀態的血管結構。Campagnolo等[3]研究表明，EGFL-7在損傷的動脈及動脈粥樣硬化的管腔內皮大量表達。在分別用低氧和磷酸酶誘導的冠狀動脈內皮細胞損傷中，EGFL-7可通過抑制核轉錄因子（NF）-κB及細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達來刺激血管再生[10-11]。可見EGFL-7通過影響血管內皮細胞的遷移，成為促進內皮細胞血管重塑的關鍵。本實驗發現，糖尿病大鼠腦組織中EGFL-7表達增多，表明大鼠腦組織存在內皮細胞損傷，血管再生系統激活，引起血管內皮細胞增生，導致血管增生和血管重塑。但其相關的機制和作用仍需進一步深入研究。

3.3 氨基胍及Baicalein對糖尿病大鼠腦血管內皮的保護作用 本實驗還發現氨基胍及Baicalein能夠降低EGFL-7的表達，起到保護腦血管的作用。氨基胍是一種親質子肼類化合物，可阻止糖基化終末產物（AGEs）的生成，改善在高血糖狀態下AGEs在血管壁上的積聚，從而減少對血管內皮細胞的損傷。但因為其不良反應較大，限制了臨床應用。Baicalein又名黃芩素，是中藥黃芩提取的黃酮類化合物，具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用，本實驗結果顯示，氨基胍、Baicalein在一定程度上參與了抑制血管再生及重建，改善血管內皮損傷的作用，因此相對于氨基胍的不良反應，Baicalein有望應用于糖尿病血管重塑的臨床治療。

Fig.1 Expressions of EGFL-7 in four groups（DAD staining,×400）圖1 各組大鼠腦組織EGFL-7的表達（DAB染色，×400）

Fig.2 Expressions of EGFL-7 in brain tissue measured by Western blotting assay in four groups圖2 Western blotting檢測大鼠腦組織EGFL-7蛋白表達的結果

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（2014-01-10收稿 2014-07-17修回）

（本文編輯 李鵬）

The Expression of EGFL-7 in Brain Tissue of Type 2 Diabetic Rats and the Adjusting Function of Amioguanidine and Baicalein

WANG Qiong,LI Huimian△
Department of The Cadre Ward,The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China△

E-mail:lihuimian630308@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of epidermal growth factor-like domain 7(EGFL-7)in brain tissue of diabetes mellitus(DM)rats,and the intervene effect of amioguanidine and baicalein thereof.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into following four groups:control group,diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group(n=12 for each group).The control group

only pelleted food and water.Diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group were given high fat and sugar diet in combination with small dose of intraperitoneal injection of streptozotocin to establish the diabetic model.And then aminoguanidine group and baicalein group were given aminoguanidine and baicalein 150 mg/(kg·d)through oral gavaging.Diabetic group and control group were given equivalent saline through oral gavaging.After 16-week treatment,the expression of EGFL-7 proteins in rat brain was detected by immunohistochemistry and Western blotting methods.ResultsResultsof immunohistochemistry and Western blotting assay showed that the expression of EGFL-7 was significantly increased in diabetic group,aminoguanidine group and baicalein group compared with that of control group(P＜0.01).When compared with diabetic group,the expression of EGFL-7 was significantly decreased in aminoguanidine group and baicalein group(P＜0.01).There was no significant difference in the EGFL-7 expression between aminoguanidine group and baicalein group(P＞0.05).ConclusionEGFL-7 may play an important role in cerebral vascular hyperplasia and remodeling of diabetic rats.Aminoguanidine and baicalein restrained cerebral vessel growth by reducing the expression of EGFL-7.

diabetes mellitus,type 2；EGFL-7；amioguanidine；Baicalein;vascular hyperplsia;vascular remodeling

R743

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.003

河南省科技廳科技攻關項目（122102310603）

鄭州大學第二附屬醫院干部病房（郵編450000）△

E-mail：lihuimian630308@163.com