利多卡因對背根節神經元誘發簇放電的影響及機制

孫 濤宋 英雷 振

實驗研究

利多卡因對背根節神經元誘發簇放電的影響及機制

孫 濤1，2宋 英3雷 振4△

目的 探討低濃度利多卡因對慢性背根節壓迫（CCD）模型大鼠背根節（DRG）神經元誘發簇放電（EB）的影響及電流機制。方法24只SD大鼠分為正常對照組和CCD組，每組12只。CCD組用小鋼柱在左側腰4、5背根節行慢性壓迫，正常對照組未做任何處理。應用在體細胞內技術記錄2組大鼠EB放電的發生率及利多卡因對閾下膜電位振蕩的影響，用離體全細胞膜片鉗技術記錄不同濃度利多卡因對持續性鈉電流（INaP）的影響。結果CCD 組EB發生率增高，達45.97％（57/124），和正常對照組相比差異有統計學意義（χ2=26.810,P＜0.01）；DRG局部給予低濃度（50 μmol/L）利多卡因抑制INaP，致閾下膜電位振蕩幅度抑制，進而影響EB發生。結論低濃度利多卡因通過阻斷INaP抑制EB放電而發揮外周鎮痛作用。

神經元；利多卡因；背根節神經元；誘發簇放電；鈉電流

觸誘發痛是神經病理性疼痛的常見癥狀，目前臨床上缺乏有效治療方法[1]。研究顯示外周神經損傷后，損傷區域及相應的背根節（DRG）Aβ神經元胞體興奮性增高及產生的異位自發放電活動，可能是觸誘發痛的直接原因[2]，但其參與觸誘發痛發生的確切機制還不清楚。本課題組已經在慢性背根節壓迫（CCD）模型大鼠DRG的Aβ神經元記錄到一種放電模式，命名為誘發簇放電（evoked-bursting，EB）[3]，推測其可能是觸誘發痛的電信號。利多卡因靜脈或口服給藥可用于治療神經病理痛，但會有惡心、嘔吐、眩暈等不良反應。本研究主要應用電生理學方法，觀察低濃度利多卡因對DRG神經元EB放電的影響，探討其能否作為抑制觸誘發痛的外周鎮痛藥物。

1 材料與方法

1.1 主要溶液與試劑 人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF，mmol/L）：NaCl 125、KCl 3.8、NaH2PO31.2、NaHCO326、葡萄糖10、MgCl21.0、CaCl22.0，pH 7.4；電極內液（mmol/L）：葡糖酸鉀115、KCl 25、NaCl 9、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）10、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）0.2、MgCl21、K2-ATP 3，pH 7.4；測持續性鈉電流（persistent sodium cur-rent，INaP）電極內液（mmol/L）：氟化銫130、NaCl 9、HEPES 10、EGTA 10、MgCl21、K2-ATP 3，pH 7.4；測INaP灌流液（mmol/L）：NaCl 131、HEPES10、KCl 3、葡萄糖10、CaCl21、MgCl22、氯化四乙胺（TEA-Cl）10、氯化銫10、4-氨基吡啶3、氯化鎘0.3，pH 7.4；消化液含人工腦脊液100 mL，蛋白酶40 mg，膠原酶100 mg；蛋白酶、膠原酶、HEPES、EGTA、K2-ATP、利多卡因均為美國Sigma公司產品，其余試劑均為國產分析純。

1.2 實驗對象及模型建立分組 健康Sprague-Dawley（SD）大鼠由徐州醫學院實驗動物中心提供，雌雄不限，體質量180～250 g。將24只SD大鼠分為2組：正常對照組12只，CCD模型組12只。CCD組腹腔注射1％戊巴比妥鈉40 mg/ kg麻醉，手術暴露左側L4和L5椎間孔，將直徑0.4 mm，長4 mm“L”型不銹鋼柱插入孔內，對相應DRG形成穩定壓迫。術畢切口處用青霉素抗感染，逐層縫合肌肉和皮膚。正常對照組未做任何處理。

1.3 機械痛敏行為學測試 2組大鼠均進行行為學測試，測試前大鼠在測試籠內適應30 min，室溫控制在（20±2）℃，再按刺激強度遞增順序依次施加Von Frey纖維細絲（1～26 g）至大鼠足底中心，以細絲稍微彎曲作為完全受力標準，連續測量5次，間隔15 s，5次檢查過程中抬腿次數≥3次的值為機械縮足反射閾值（paw withdraw threshold，PWT）。

1.4 在體細胞內記錄 2組大鼠術后2～8 d在17.0％烏拉坦及1.0％α-氯醛糖復合麻醉藥腹腔注射麻醉下（5.0 mL/kg），常規手術暴露L4和L5 DRG，用脊柱固定器將大鼠固定，提起切口周圍皮膚及筋膜做一灌流槽，充灌ACSF，撕除DRG表面被膜，在顯微鏡下，將尖端電阻40～60 MΩ，內充3 mol/L乙酸鉀的玻璃微電極刺入胞內，記錄信號經AxoClamp-700A放大器采集輸入計算機存儲。觀察利多卡因對EB作用時選取1 200 ms時間段的閾下膜電位振蕩（SMPO）進行傅里葉變換分析（FFT），觀察藥物的作用。

1.5 離體膜片鉗記錄 2組大鼠術后2～8 d經戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg/kg），暴露L4和L5 DRG，取出帶外周神經DRG至于ACSF，剝除表面被膜，在消化液中消化45 min，取出孵育1 h后移至記錄槽，壓片固定，吸引電極固定游離的神經末端。在顯微鏡下用電阻為4～8 MΩ，充灌電極內液玻璃微電極進行巨阻封接，破膜后形成全細胞記錄模式。在檢測INaP時需采用二次鉗制方法：首先形成全細胞記錄，檢測細胞放電模式，更換電極，充灌測INaP電極內液，再次鉗制，同時細胞外液置換測鈉外液，在電壓鉗測量INaP。

1.6 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計處理，計量數據以±s表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，率的比較用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學結果 CCD組術后24 h術側后肢出現觸誘發痛現象，PWT術后開始下降，此敏化狀態持續至術后10 d，而正常對照組大鼠同側后肢PWT在持續的檢測過程中沒有明顯改變，2組術后各時點組間比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Paw withdraw threshold test in normal control and CCD groups of rats表1 正常對照組和CCD組大鼠機械縮足閾值測試（n=12，g，±s）

Tab.1 Paw withdraw threshold test in normal control and CCD groups of rats表1 正常對照組和CCD組大鼠機械縮足閾值測試（n=12，g，±s）

＊＊P＜0.01

組別正常對照組CCD組t術前1 d 14.17±1.94 13.75±2.26 0.484術后1 d 14.58±1.44 3.10±2.03 15.962＊＊術后2 d 15.00±0.00 2.55±1.35 31.724＊＊組別正常對照組CCD組t術后4 d 14.58±0.41 2.71±1.80 23.587＊＊術后6 d 12.50±2.61 2.96±1.75 10.503＊＊術后10 d 13.75±2.26 4.25±2.17 10.478＊＊

2.2 EB放電發生率 正常對照組外周感受野給予輕觸刺激，在DRG Aβ神經元記錄到離散、動作電位間期不規則的多個放電，刺激停止后，放電中止；坐骨神經電刺激在DRG只記錄到1個動作電位，見圖1。CCD組，外周感受野觸刺激誘發部分Aβ神經元胞體產生高頻簇放電（＞70 Hz），放電持續時程超出刺激時間；給予坐骨神經電刺激（0.1 mA，0.05 ms）也可誘發胞體產生長時程的高頻簇放電（＞70 Hz），見圖1，即EB。正常對照組EB的出現率僅為14.55％（16/110）；CCD組術后Aβ神經元EB出現率達45.97％（57/124），和正常對照組相比差異有統計學意義（χ2=26.810,P＜0.01）。

Fig.1 The reactive mode of DRG neurons to stimuli applied on peripheral receptive field in normal and CCD groups圖1 正常對照組和CCD組DRG神經元對外周感受野刺激的反應模式

2.3 利多卡因對EB影響及電流機制 在記錄液槽中加入利多卡因1滴（10 μL），液槽內終濃度為50 μmol/L，3 min后可見EB串長減小，5 min后EB完全消除，但坐骨神經刺激誘發的首個動作電位不受影響，洗脫后10 min EB部分恢復（n＝5），對膜電位沒有顯著影響，見圖2A。圖2B顯示加藥后3、4、5 min局部膜電位的放大圖，圖中可見SMPO，FFT分析顯示此濃度利多卡因主要影響振蕩幅值，而對振蕩頻率沒有顯著影響，見圖2C。

更換外液及電極內液后對EB神經元二次鉗制，測量INaP，在-60 mV膜電位水平，給予胞體從-80～0 mV，時程為3 s的去極化斜波刺激，細胞在去極化刺激過程中出現較長時程內向持續電流，在-55 mV左右被激活，-35 mV左右達峰值，即INap。利多卡因在1 μmol/L時可以將INaP的峰值抑制（29.00±7.70）％ （n=6），且有濃度依賴性，在應用10及50 μmol/L利多卡因對INaP的抑制程度分別為（65.71±6.76）％（n= 5）和（90.30±4.96）％（n=4），見圖3。

Fig.2 The effects of lidocaine on EB firing and SMPO圖2 利多卡因對EB放電及SMPO的作用

Fig.3 The effects of lidociane on INaPof EB neurons圖3 利多卡因對EB神經元INaP的影響

3 討論

3.1 利多卡因的臨床應用 利多卡因是臨床常用的局部麻醉藥，靜脈全身給藥可以用于治療慢性痛綜合征[4]，但因心臟和中樞神經系統的不良反應未能廣泛應用。近年來臨床運用利多卡因治療神經病理痛獲得了很大的關注，但是其作用機制尚不清楚。

3.2 背根節EB放電參與觸誘發痛的發生 觸誘發痛是神經病理性疼痛的常見癥狀，產生機制不清，目前臨床上缺乏有效治療方法，是疼痛研究領域關注的一個難點[1]。本研究在前期CCD大鼠DRG神經元記錄到一種由外周刺激誘發胞體產生的長時程簇放電，即EB，該放電模式有效地放大了外周傳入的電信號，能有效增強脊髓背角突觸傳遞效率，契合了臨床輕觸刺激誘發劇烈、電擊樣觸誘發痛的感覺特征，推測可能是觸誘發痛的外周痛信號[3]。而且DRG處于血腦屏障之外，如果能在DRG局部使用利多卡因干擾EB放電，不但能抑制慢性痛信號發生，而且能避免全身給藥帶來的中樞神經系統的不良反應。

3.3 EB與SMPO的關系 SMPO是受損DRG神經元出現的膜電位周期性波動，是DRG神經元異位自發放電產生的必要條件[5-6]。本研究結果顯示EB的發生與SMPO密切相關，50 μmol/L利多卡因可以通過抑制SMPO而抑制EB放電的發生，但外周刺激誘發的首個動作電位的傳導沒有影響，即不影響正常外周動作電位的傳導，該結果與文獻報道[2]一致。

3.4 利多卡因外周鎮痛的可能機制 神經病理性痛情況下DRG神經元產生SMPO的機制與電壓依賴性鈉電流和鉀電流之間的平衡有關[7]。電壓依賴性的INap可以影響神經元的靜息膜電位水平，使之向去極化方向漂移，參與SMPO的產生，從而增大神經元對閾下刺激反應的敏感性。本研究結果顯示，利多卡因明顯降低EB神經元的INap，推測DRG局部給予低濃度利多卡因可通過阻斷INap抑制SMPO的幅度，進而抑制EB放電模式，從而發揮外周鎮痛作用。

[1]Louter M,Wardenaar K,Veen G,et al.Allodynia is associated with a higher prevalence of depression in migraine patients[J].Cephalalgia，2014，34（7）：568-577.

[2]Xie RG,Zheng DW,Xing JL,et al.Blockade of persistent sodium currents contributes to the riluzole-induced Inhibition of spontaneous activity and oscillations in injured DRG neurons[J].PLoS One，2011，6（4）:e18681.doi:10.1371/journal.pone.0018681.

[3]Song Y,Li HM,Xie RG,et al.Evoked bursting in injured Abeta dorsal root ganglion neurons:a mechanism underlying tactile allodynia[J]. Pain，2012，153（3）:657-665.doi:10.1016/j.pain.2011.11.030.

[4]Dong H,Fan YH,Wang YY,et al.Lidocaine suppresses subthreshold oscillations by inhibiting persistent Na（+）current in injured dorsal root ganglion neurons[J].Physiol Res，2008，57（4）:639-645.

[5]Devor M.Ectopic discharge in Abeta afferents as a source of neuropathic pain[J].Exp Brain Res，2009，196（1）:115-128.doi: 10.1007/s00221-009-1724-6.

[6]Devor M,Amir R,Rappaport ZH.Pathophysiology of trigeminal neuralgia:the ignition hypothesis[J].Clin J Pain，2002，18（1）:4-13.

[7]Hsiao CF,Kaur G,Vong A,et al.Participation of Kv1 channels in control of membrane excitability and burst generation in mesencephalic V neurons[J].J Neurophysiol，2009，101（3）:1407-1418. doi:10.1152/jn.91053.

（2014-04-23收稿 2014-06-24修回）

（本文編輯 李鵬）

The Effects and Mechanism of Lidocaine on Evoked-Bursting Firing of Injured Dorsal Root Ganglion Neurons

SUN Tao1,2,SONG Ying3,LEI Zhen4△
1Liaoning Medical College,Liaoning 121000,China;2The Xingcheng Sanatorium of Shenyang Military Region;3Department of Anesthetic Physiology,Xuzhou Medical College;4First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College
△

E-mail:leizhen2004@163.com

ObjectiveTo study the effects and current mechanism of low concentration of lidocaine on evokedbursting(EB)firing of dorsal root ganglion(DRG)neurons in rat model of chronic compression(CCD)of DRG．MethodsTwenty-four SD rats were divided into normal control group(n=12)and CCD model group(n=12).CCD group was treated with chronic oppression on L4 and L5 DRG with L shape bar.Normal control group

no treatment.In vivo intracellular recording was used to record the incidence of EB and the effect of lidocaine on subthreshold membrane potential oscillation(SMPO).Patch clamp recording was used to record the effect of lidocaine on persistent sodium current(INaP).ResultsThe incidence of EB increased in CCD group(45.97％,57/124),which was significantly different when compared with normal group(χ2=26.810,P＜0.01).The magnitude of SMPO,INaPand EB were inhibited in a reversible way by lidocaine(50 μmol/L).ConclusionThe low concentration of lidocaine might play an analgesic effect in peripheral nervous system by selectively inhibiting INap,which participates in SMPO formation.

neurons；lidocaine；dorsal root ganglion neuron；evoked-bursting;sodium current

R338.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.005

國家自然科學青年科學基金項目（31200836）

1遼寧醫學院（郵編121000）；2沈陽軍區興城療養院；3徐州醫學院麻醉學院；4遼寧醫學院附屬第一醫院

△通訊作者 E-mail:leizhen2004@163.com