鞘內注射阿片復合納洛酮對切口痛大鼠痛行為學及血漿胃動素的影響

趙 軍高寶柱△ 鄭寶森曹君利

鞘內注射阿片復合納洛酮對切口痛大鼠痛行為學及血漿胃動素的影響

趙 軍1高寶柱1△鄭寶森2曹君利3

目的 觀察鞘內注射嗎啡、芬太尼復合小劑量納洛酮對切口痛大鼠痛行為學及血漿胃動素（MTL）的影響。方法取鞘內置管成功的健康雄性SD大鼠72只，隨機分為6組（n=12）：生理鹽水（NS）組，切口痛（P）組，嗎啡（5 μg/kg）＋芬太尼（0.25 μg/kg）組（MFP組），嗎啡＋芬太尼+納洛酮1（0.2 ng/kg）、2（1 ng/kg）、3（5 ng/kg）組（MFPN1、2、3組）。后5組行足跖肌切口。各組取其中6只于鞘內置管前24 h（T0）、造模前24 h（T1）、術后1 h（T2）、3 h（T3）、6 h（T4）、24 h（T5）、48 h（T6）、72 h（T7）檢測機械縮足閾值（PWMT）與熱縮足反射潛伏期（PWTL），剩余6只于術后6 h即刻斷頭處死，取血漿以ELISA法檢測MTL濃度。結果MFPN2組與NS組各時點PWMT差異無統計學意義，而與NS組相比，T2、T5時點PWTL上調（P＜0.05），其余各時點差異無統計學意義。P組、MFPN3組與NS組比較，T2、T3、T4時點PWMT、PWTL顯著下調（P＜0.05）。而MFPN3組與P組比較，T6時點PWMT及T3、T4時點PWTL下調更為顯著（P＜0.05）。P、MFP、MFPN1、MFPN3組與NS組比較，術后6 h MTL表達下調（P＜0.05）。而MFPN2 與NS組MTL表達差異無統計學意義。結論鞘內注射1 ng/kg納洛酮抑制了嗎啡＋芬太尼對切口痛大鼠血漿MTL表達的影響，并能上調大鼠熱輻射痛閾值，增強了阿片類藥物的鎮痛效果。

促胃動素；嗎啡；納洛酮；芬太尼；切口痛；胃腸動力

胃動素（motilin，MTL）在外周主要分布于胃、十二指腸、空腸上段及血漿，參與調節胃腸平滑肌細胞收縮的信號通路，可通過加強胃腸道平滑肌的收縮，引起胃腸蠕動能力增強，在胃腸動力調控中起重要作用[1-2]。有文獻表明，阿片類藥物可通過下調胃腸道內MTL分泌，降低胃腸蠕動能力[3-4]。而小劑量納洛酮可逆轉阿片類藥物對胃腸MTL的影響，同時不減弱其鎮痛效果[5]。但不同劑量納洛酮在急性疼痛及阿片類藥物鎮痛條件下對鎮痛效果、血漿MTL表達的影響及機制尚不清楚。本研究擬探討鞘內注射小劑量納洛酮復合嗎啡、芬太尼對切口痛大鼠痛行為學及血漿MTL表達的影響，為臨床研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量180～220 g，徐州醫學院實驗動物中心提供。每籠5只飼養，自然照明，自由攝食、飲水；MTL ELISA試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，進口分裝）；嗎啡（批號：091204-1，東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠）；芬太尼（批號：100302，湖北宜昌人福藥業有限責任公司）；納洛酮（批號：h20093199，國藥集團國瑞藥業有限公司）；PE10導管（寧波安來軟件科技有限公司）；Von Frey纖維絲（IITC公司，美國）；熱痛刺激儀Model 390 Heated Base（IITC公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 鞘內置管 參照文獻[6]方法行鞘內置管。大鼠清醒后24 h觀察其活動情況，剔除運動功能障礙大鼠。鞘內注射2％利多卡因20 μL，出現雙后肢麻痹為置管成功。

1.2.2 疼痛模型制備 參照Brennan法[7]，大鼠七氟烷吸入麻醉后右足底近端0.5 cm處向趾部做一長約1 cm切口，切開皮膚筋膜，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，但保持肌肉起止及附著完整，皮膚縫合，切口以青霉素藥液沖洗。

1.2.3 分組及給藥方法 鞘內置管89只，其中術后死亡9只，給予利多卡因后單側后肢麻痹8只，棄用。取置管成功大鼠72只，采用隨機數字表法分為6組（n=12）：生理鹽水（NS）組、切口痛（P）組、嗎啡＋芬太尼（MFP）組、嗎啡＋芬太尼+納洛酮1（MFPN1）組、嗎啡＋芬太尼+納洛酮2（MFPN2）組、嗎啡＋芬太尼+納洛酮3（MFPN3）組。P組、MFP組、MFPN1組、MFPN2組、MFPN3組行右后足跖肌切口；MFP組、MFPN1組、MFPN2組、MFPN3組在造模前20 min鞘內分別給予嗎啡5 μg/kg+芬太尼0.25 μg/kg混合液。MFPN1組、MFPN2組、MFPN3組分別鞘內給予納洛酮0.2、1、5 ng/kg。NS組、P組給予NS。各組藥液均以NS稀釋至50 μL鞘內注射。

1.2.4 指標測定 各組取其中6只于鞘內置管前24 h（T0），造模前24 h（T1），術后1 h（T2）、3 h（T3）、6 h（T4）、24 h（T5）、48 h（T6）、72 h（T7）檢測痛行為學指標，包括機械縮足閾值（PWMT）和熱縮足反射潛伏期（PWTL）。各組取剩余6只，術后6 h即刻斷頭處死，取血漿，以ELISA法檢測MTL濃度。（1）PWMT測定。將一透明有機玻璃箱（其中每一隔間尺寸為22 cm×22 cm×12 cm）置于30 cm高的金屬篩網（網格1 cm×1 cm）上，待大鼠在箱中適應30 min后，以電子Von Frey纖維絲垂直，以相同強度刺激大鼠左右后足與附近第3、4趾間皮膚，每次持續4～6 s。大鼠出現抬足或舔足行為視為陽性反應。記錄刺激強度數值，每次間隔15 s以上，共刺激5次，計算其平均值為PWMT。（2）PWTL測定。將有機玻璃箱置于3 mm厚玻璃板上，大鼠放入箱內，使其自由活動30 min以適應測試環境和溫度。室溫穩定在（25±1）℃。用熱輻射儀照射大鼠足底緊貼玻璃板部位。與PWMT測定部位相同。記錄照射開始至大鼠出現抬足或舔足時間，截止時間為20 s，以防止組織損傷。實驗中，熱刺激強度保持相同。每只動物重復5次，每次間隔至少5 min，取后刺激3次的平均值為PWTL。（3）MTL測定。開腹經下腔靜脈抽血2 mL，置于含30 μL 10％EDTA二鈉和40 μL抑肽酶（2萬U/ mL）試管中混勻，4℃、3 500 r/min離心20 min，取血漿置于-20℃冰箱保存。以ELISA法同批檢測MTL濃度。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。采用重復測量資料的方差分析或單因素方差分析，組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時點大鼠PWMT變化 見表1。MFPN2組各時點PWMT與NS組比較差異無統計學意義（P＞0.05），P組、MFPN3組T2～T6時點PWMT與NS組比較降低（P＜0.05）。MFP組與NS組比較，PWMT于T5開始降低（P＜0.05），于T6升高至生理水平，表明該劑量嗎啡＋芬太尼對機械痛刺激鎮痛時效不超過24 h。與P組比較，MFPN3組PWMT 于T6時點顯著降低（P＜0.05）。

Tab.1 Changes of PWMT at different time points in six groups表1 不同時點對各組大鼠PWMT變化 （n=6，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與P組比較，c與MFP組比較，d與MFPN1組比較，e與MFPN2組比較,P＜0.05；表2、3同；F時間= 12.345、F交互=4.141、F組間=7.864，均P＜0.01

組別NS組P組MFP組MFPN1組MFPN2組MFPN3組F T0 42.1±7.6 41.0±8.3 42.1±8.6 41.4±5.8 42.6±5.0 42.6±5.0 0.236 T1 44.0±11.8 41.0±8.2 40.3±12.6 42.2±16.4 42.5±8.7 40.3±12.6 0.476 T2 42.6±10.6 19.1±7.6a46.0±9.2b41.3±9.2b42.0±6.7b23.4±3.4acde12.330＊＊T3 44.0±7.1 16.3±4.9a46.5±13.2b40.0±3.7b41.5±13.5b23.3±6.6acde11.651＊＊T4 43.0±8.7 17.5±5.3a40.0±8.7b34.9±5.1b39.1±14.7b24.6±5.6acde12.034＊＊T5 42.6±6.6 24.7±10.4a32.4±14.4a27.3±3.3a38.5±14.8bd30.0±6.3ae3.522＊T6 41.8±7.3 30.1±12.7a42.7±5.2b33.9±3.4 38.9±19.0b19.8±4.8abcde6.302＊＊T7 43.3±6.1 40.1±7.9 51.8±9.7 39.5±2.3 42.6±20.2 35.1±10.5c1.750

2.2 不同時點大鼠PWTL變化 MFPN2與NS組比較，T2、T5時點PWTL延長（P＜0.05），其余各時點差異無統計學意義。P組與NS組比較，T2、T3、T4時點PWTL縮短（P＜0.05）。MFPN3組與NS組比較，T2～T6時點PWTL縮短（P＜0.05）。MFPN1組與NS組比較，于T4時點PWMT縮短（P＜0.05），表明0.2 ng/kg劑量納洛酮使用后輕度影響了嗎啡＋芬太尼鎮痛效果，使有效鎮痛時間縮短。與P組比較，MFPN3組于T3、T4時點PWTL縮短（P＜0.05），表明MFPN3組在上述時點可能出現熱痛超敏現象，見表2。

Tab.2 Changes of PWTL at different time points in six groups表2 不同時點對各組大鼠PWTL變化（n=6，g，±s）

Tab.2 Changes of PWTL at different time points in six groups表2 不同時點對各組大鼠PWTL變化（n=6，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F時間=1.677，P＞0.05；F交互=2.131，P＜0.01；F組間=9.123，P＜0.01

組別NS組P組MFP組MFPN1組MFPN2組MFPN3組F T0 10.2±1.6 12.9±2.5 11.1±2.4 10.1±1.8 11.2±2.4 9.2±2.3 0.837 T1 12.0±2.5 11.8±3.8 10.2±3.1 10.3±3.7 12.5±2.8 10.2±3.1 0.464 T2 11.1±3.2 8.7±2.1a11.2±4.3 13.3±3.5b15.1±4.5abc7.3±2.1acde4.689＊＊T3 12.6±2.4 7.3±1.9a11.5±3.2b13.2±4.0b13.4±4.9b4.7±2.6abcde8.768＊＊組別NS組P組MFP組MFPN1組MFPN2組MFPN3組F T4 12.0±2.2 8.6±3.9a10.1±2.9 7.2±0.8a13.1±6.8b4.4±2.2abce6.282＊＊T5 11.4±1.6 9.4±5.9 8.0±1.3 10.1±4.2 14.8±5.5abcd7.0±1.0ae4.012＊＊T6 11.0±1.4 9.7±3.6 9.2±1.6 12.0±4.9c13.4±4.9c6.3±0.4ade3.017＊T7 11.2±2.4 10.3±2.4 10.3±1.4 12.9±5.1 12.7±2.4 9.6±1.1 2.322

2.3 MTL的變化 MFPN2組與NS組比較MTL表達差異無統計學意義[（228.5±23.6）pmol/L vs（239.6± 3.3）pmol/L，P＞0.05]。與 NS組比較，P、MFP、MFPN1、MFPN3組表達下調[分別為146.3±20.3）、（180.9±12.0）、（182.0±35.7）、（162.8±21.9）pmol/L，F= 13.987，P＜0.01]；與P組比較，MFPN2組表達上調；與MFP組比較，MFPN2組表達上調；MFPN3組較MFPN2組表達下調；P組與MFPN3組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

3.1 前期研究及本研究的相關性及實驗方法的依據 本課題組前期研究結果表明，子宮切除術患者術前鞘內注射嗎啡復合芬太尼可取得滿意的術后鎮痛效果[8]，但術后胃腸道并發癥發生概率較高；而小劑量納洛酮可不降低阿片類藥物鎮痛效果，同時減少胃腸道并發癥[5,9]，因此本研究選擇嗎啡+芬太尼復合小劑量納洛酮給藥，在保證鎮痛效果前提下，評價其對血漿MTL的影響，進而評估其對胃腸動力的影響。Spofford等[10]研究表明，切口痛大鼠痛覺過敏以術后24 h內最明顯。預實驗結果表明，鞘內注射嗎啡5 μg/kg+芬太尼0.25 μg/kg以及納洛酮1 ng/kg復合上述劑量嗎啡+芬太尼均可保證術后6 h有效鎮痛；因此本研究選擇于術后6 h取標本，以避免鎮痛不全對MTL的影響。

3.2 超小劑量納洛酮增加鎮痛效果的機制 Tsai 等[3-4,9]研究發現，超小劑量納洛酮通過促進谷氨酸轉運體（L-glutamate transporters，GTs）表達的下調以及抑制脊髓神經元炎性反應等機制，可修復或增強嗎啡對百日咳毒素處理大鼠的熱痛敏的抗傷害作用。本研究結果表明，鞘內給予1 ng/kg納洛酮復合嗎啡芬太尼，術后72 h內可保持切口痛大鼠PWMT接近于NS組，同時其PWTL（T2、T5）上調。此結果與Tsai等[3-4,9]研究結果一致，再次驗證小劑量納洛酮與阿片類藥物復合可不降低甚至增強鎮痛效果的結論，表明該劑量納洛酮在選擇性阻斷Gs蛋白偶聯阿片受體的興奮性作用中，對中樞熱輻射痛調控影響更顯著，這可能和參與熱輻射痛調控的阿片受體與G蛋白偶聯程度變化有關，同時小劑量納洛酮還可通過下調GTs表達，從而抑制興奮性氨基酸的釋放后再攝取而強化嗎啡的鎮痛作用[9]。在本研究中，MFPN3組的PWMT與PWTL給藥后各時點均接近或低于P組，說明該劑量納洛酮已完全拮抗嗎啡+芬太尼的鎮痛作用，尤其切口側PWTL甚至低于P組，表明大劑量納洛酮可能參與中樞痛覺敏化的形成。臨床上常見術后給予納洛酮拮抗阿片類藥物后，患者疼痛加重、煩躁不安等，可能與納洛酮介導的熱痛閾值下調有關。

3.3 切口痛、阿片類藥物及不同劑量納洛酮對血漿胃動素的影響 研究顯示，腸易激綜合征患者血漿MTL水平顯著升高；而糖尿病性胃輕癱患者血漿MTL水平顯著下降，靜脈給予MTL后，癥狀明顯改善，表明血漿MTL與胃腸動力呈正相關，其血漿濃度變化趨勢可以間接體現胃腸動力狀態[11-12]。本研究顯示，用1 ng/kg納洛酮復合嗎啡+芬太尼可以抑制切口痛、阿片類藥參與的MTL表達的變化，進而參與穩定大鼠胃腸動力。有文獻報道阿片類藥物用于術后鎮痛引起的胃腸道不適，如惡心嘔吐等與MTL升高有關[13]。但本研究顯示，疼痛與阿片類藥物及大劑量納洛酮可下調血漿MTL表達，原因可能是由于阿片類藥對MTL影響呈劑量依賴有關。本研究阿片類藥物劑量較小，可能對血漿MTL表達呈抑制作用。切口痛6 h后，除MFPN2組，其余各組血漿MTL表達均顯著下調，提示胃腸動力減退，這與臨床術后患者疼痛、阿片類藥物鎮痛及納洛酮劑量使用不當引起患者胃腸功能減弱的臨床癥狀相吻合。因此，血漿MTL可能作為術后胃腸動力的檢測指標，但其發揮早期預警及用藥指導作用還需進一步研究證實。

總之，鞘內注射1 ng/kg納洛酮抑制了嗎啡芬太尼、切口痛對大鼠血漿MTL表達的影響，并能上調大鼠熱輻射痛閾值，增強阿片類藥物的鎮痛效果。

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（2014-03-06收稿 2014-07-11修回）

（本文編輯 李鵬）

Effects of Intrathecal Injection of Opioid Compound with Low-Dose Naloxone on Pain Behavior and Blood Motilin in a Rat Model of Incisional Pain

ZHAO Jun1,GAO Baozhu1△,ZHENG Baosen2,CAO Junli3
1Department of Anesthesiology,the Third Central Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300170,China; 2 The Second Affiliated Hospital of Tianjin Medical University;3 Xuzhou Medical College
△

E-mail:gbz1953@126.com

ObjectiveTo investigate effects of intrathecal injection of morphine and fentanyl combined with lowdose naloxone on the pain behavior and the expression of blood motilin(MTL)in the rat model of incisional pain．MethodsA total of 72 healthy male Sprague-Dawley rats(weight 180-220 g),successfully intrathecally catheterized,were randomly divided into 6 groups(n=12):normal saline group(NS group),incisional pain group(P group),morphine(5 μg/kg)+ fentanyl(0.25 μg/kg)group(MFP group),morphine+fentanyl+naloxone(0.2 ng/kg,1 ng/kg,5 ng/kg)group(MFPN1,MFPN2 and MFPN3 groups).All groups except NS group were made the model of incisional pain on the right plantar surface.At 24-hours before intrathecal cathetherization(T0),24-hours before modelling(T1),1-hours(T2),3-hours(T3),6-hours (T4),24-hours(T5),48-hours(T6)and 72-hours(T7)after modelling respectively,paw withdrawal mechanical threshold (PWMT)and paw withdrawal thermal latency(PWTL)were detected in right hind paw in 6 rats of each group.The other 6 rats in each group were sacrificed 6-hour after operation.The plasma expression of motilin was detected by ELISA.ResultsCompared with NS group,the PWMT was not significantly different in all time points in MFPN2 group.The values of PWTL were significantly longer at T2 and T5 in MFPN2 group than those of NS group(P＜0.05)．The PWMT and the PWTL were significantly decreased at T2,T3 and T4 in P and MFPN3 groups than those of NS group(P＜0.05)．Compared with P group,the PWMT at T6,and PWTL at T3 and T4 were significantly decreased in MFPN3 group(P＜0.05).The MTL at T6 was significantly decreased in P,MFP,MFPN1 and MFPN3 groups compared with that of NS group(P＜0.05).There was no significant difference in MTL between MFPN2 group and NS group(P＞0.05)．ConclusionIn the rat model of incisional pain,intrathecal injection of naloxone at 1 ng/kg can inhibit the down-regulation of blood motillin caused by morphine and fentanyl,and which can up-regulate the PWTL,enhancing the analgesic effects of opioids．

motilin；morphine；naloxone；fentanyl；incisional pain；gastrointestinal dynamics

R614.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.008

天津市衛生局科技基金資助項目（2010KZ19）

1天津市第三中心醫院麻醉科（郵編300170）；2天津醫科大學第二醫院疼痛治療中心；3徐州醫學院江蘇省麻醉與鎮痛應用技術重點實驗室

△通訊作者 E-mail：gbz1953@126.com