PKH26熒光標記牛尾髓核細胞的實驗研究

丁曉明 徐寶山 伍耀宏 許海委 楊 強馬信龍 張春秋李秀蘭 張 揚

細胞與分子生物學

PKH26熒光標記牛尾髓核細胞的實驗研究

丁曉明1徐寶山2△伍耀宏1許海委2楊 強2馬信龍2張春秋3李秀蘭2張 揚2

目的 探討PKH26熒光標記在牛尾髓核細胞的應用，為髓核組織工程的體內研究提供可示蹤的種子細胞。方法從牛尾椎間盤中分離髓核組織，通過酶消化法獲取原代細胞，倒置顯微鏡下觀察，P1代髓核細胞進行番紅O、甲苯胺藍和Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色，對P1代髓核細胞進行PKH26熒光染料標記，并對標記后細胞的活性、熒光強度（0、14、28 d）、增殖特性及基因表達進行評估。結果分離得到的髓核細胞數為（1.56±0.35）×106/g，倒置顯微鏡下，原代細胞培養4 d開始貼壁，細胞成群生長，14 d鋪滿瓶底，原代細胞、P1代細胞均呈類軟骨樣細胞形態；P1代髓核細胞甲苯胺藍染色異染、番紅O染色和Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色陽性；PKH26標記前后細胞活性均在95％以上，1、14、28 d呈遞減趨勢，但28 d時細胞仍可檢測出較強的熒光，標記后的細胞增殖及基因表達（Ⅰ、Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖）與標記前的細胞相比差異無統計學意義（P＞0.05）。結論牛尾髓核組織中可以分離出數量滿意的髓核細胞，且具有軟骨樣細胞的表型，可以用作種子細胞；PKH26標記后的髓核細胞無生物學特性的變化，可以用作髓核細胞體內研究的示蹤染料。

組織工程；椎間盤；牛尾；髓核細胞；PKH26

椎間盤退變引起的下腰痛是勞動力喪失的主要原因之一，嚴重者常采用手術治療[1],但目前的治療措施未能從根本上重建正常的椎間盤結構和功能。近年來，組織工程椎間盤作為一種生物治療方法引起廣泛關注。研究發現椎間盤的退變起源于髓核，目前組織工程的研究也主要集中在髓核組織工程上，并取得了巨大進展[2]。種子細胞是組織工程的重要環節，用于髓核組織工程的種子細胞主要有干細胞、髓核細胞、軟骨細胞，其中干細胞是最具應用前景的種子細胞[3]，但干細胞誘導條件和誘導后細胞的鑒定方法尚不成熟，因此常用的種子細胞仍是髓核細胞[4]。牛尾髓核細胞具有取材方便、經濟廉價、細胞表型良好等特點，為髓核組織工程提供了新的細胞來源。本實驗對髓核細胞進行PKH26熒光標記，為進一步的種子細胞體內示蹤提供依據。

1 材料與方法

1.1 組織來源、主要試劑及儀器 新鮮牛尾。DMEM培養基、胎牛血清（GIBCO公司，美國）；乙二胺乙酸二鈉（EDTA）、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）、兔抗牛Ⅱ型膠原抗體（Abcam公司，英國）；生物素化山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；PKH26紅色熒光細胞鏈接Mini試劑盒（Sigma公司，美國）。CO2培養箱（Hera-cell公司，德國）；恒溫搖床（Heidolph公司，德國）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）。

1.2 髓核細胞分離 取剛宰殺的牛尾（雄性，3歲齡），簡單消毒后送至實驗室。無菌環境下分離出脊柱和牛尾椎間盤，取出髓核，清除其他組織，用含10萬U/L青霉素的Hanks液漂洗2遍，剪碎，加入濃度為0.2％的Ⅱ型膠原酶，與髓核組織以3∶1體積充分混合，在37℃、220 r/min搖床中消化4 h，至髓核組織基本消化完全，200目濾網過濾，收集細胞懸液，細胞計數和臺盼藍染色檢測活性，1 000 r/min離心7 min，棄上清，用含10％FBS的高糖DMEM重懸細胞沉淀，調整細胞密度為1×105/mL，接種至培養瓶，培養液為含10％胎牛血清（FBS）的高糖DMEM，置于37℃、5％(V/V)CO2的培養箱中培養。每2 d換液1次，倒置熒光顯微鏡觀察細胞生長情況，待細胞融合至80％左右，消化傳代，P1代細胞制成懸液備用。

1.3 髓核細胞鑒定 將P1代細胞懸液調整至濃度1×104/mL，接種至含有蓋玻片的24孔板中進行爬片，48 h后取出，多聚甲醛固定20 min，PBS緩沖液漂洗3遍，甲苯胺藍、番紅O染液常溫下染色15～20 min，風干，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察；按照試劑盒操作，SABC法進行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察。

1.4 PKH26熒光染料標記 胰酶和EDTA常規消化髓核細胞，用不含血清的DMEM培養基洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復2次，細胞沉淀用1 mL Diluent C溶液重懸成單個細胞，將其與1 mL濃度為4×10-6mol/L的PKH26染料混勻，室溫反應5 min，加入2 mL血清終止標記反應，1 000 r/min離心10 min，去上清，加入完全培養基洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用含10％FBS的高糖DMEM培養基重懸至所需細胞濃度1×107/mL，涂片，臺盼藍染色，觀察細胞活性，熒光顯微鏡下觀察熒光標記強度（1 d、14 d、28 d）。

1.5 PKH26標記細胞增殖活性測定 MTT檢測標記前后的髓核細胞生長曲線。取PKH26標記前后的P1代髓核細胞進行實驗，將1 mL濃度為1.0×104/mL的細胞懸液接種到24孔板上，連續培養7 d，MTT法檢測對髓核細胞增殖活性的影響。每天操作如下：每組樣本取3孔，每孔加入100μL MTT溶液，37℃下繼續培養4 h，棄去培養液，每孔加入500μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min后移入96孔板的3個孔中，每孔100 μL，96孔板在酶聯免疫檢測儀中570 nm測定光密度（OD）值。根據OD值和時間點制作生長曲線。

1.6 PKH26標記細胞基因表達測定 實時熒光定量PCR檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因表達。收集標記前后的髓核細胞，Trizol法提取總RNA，采用M-MLV反轉錄酶合成cDNA，采用SYBR Premix DimerEvaser建立反應體系，分別擴增Ⅰ、Ⅱ型膠原和Aggrecan，以β-actin作為內參。實驗采用Primier 5.0設計引物序列，由北京諾賽基因組研究中心合成。引物序列：β-actin上游5′-AGGTTGGCTCTGACTGT-3′，下游5′-TCTCCTTAATGTCACGCACG-3′；Ⅰ型膠原上游5′-AGGGAGTTTACAGGAAGCAGACA-3′，下游5′-CGAATACAAAACCACCAAGACC-3′；Ⅱ型膠原上游5′-TTCAGCTATGGAGATGACAATC-3′，下 游 5′-AGAGT CCTAGAGTGACTGAG-3′；Aggrecan上游 5′-GAGATGGAGGGTGAGGTC-3′，下游5′-ACGCTGCCTCGGGCTTC-3′。將各樣本放入ABI PRIS M?7500熒光定量PCR儀，按下列條件擴增：95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、60 s，45個循環。以β-actin作內參照，用LightCycler Software Ver.4.0軟件分析目的基因的相對表達水平。

1.7 統計學方法 用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理。數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 髓核細胞分離及鑒定結果 從牛尾髓核組織中分離的髓核細胞數量為（1.56±0.35）×106/g，細胞活性為95％以上，牛尾髓核原代細胞4 d開始貼壁，7 d可見細胞聚集成群生長，14 d長滿瓶底，胞漿飽滿，細胞呈卵圓形或短梭形，類軟骨樣細胞形態，見圖1。P1代細胞形態與原代細胞相同，呈類軟骨樣細胞形態，見圖2。細胞番紅O和甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ型膠原免疫細胞化學陽性，見圖3。

2.2 髓核細胞PKH26標記 髓核細胞標記后，臺盼藍染色標記后細胞活性仍能保持95％以上，對細胞活性無影響，熒光顯微鏡下細胞呈紅色熒光，熒光強烈且分布均勻，1 d、14 d、28 d熒光呈減弱趨勢，但28 d時仍可觀察到較強熒光，見圖4。MTT檢測結果證明PKH26標記前后髓核細胞各增殖時間點的OD值無明顯的差異，見表1。PKH26標記前后髓核細胞Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan基因表達相對定量比較差異均無統計學意義（t分別為2.671、1.021、0.870，均P＞0.05），見圖5。

Fig.1 Primary nucleus pulposus cells(inverted phase contrast microscope，×100)圖1 原代髓核細胞（倒置相差顯微鏡，×100）

Fig.2 P1 generation of nucleus pulposus cells(inverted phase contrast microscope，×100)圖2 P1代髓核細胞（倒置相差顯微鏡，×100）

Tab.1 Comparison of the proliferations of nucleus pulposus cells before and after PKH26 labeling表1 PKH標記前后髓核細胞增殖情況比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of the proliferations of nucleus pulposus cells before and after PKH26 labeling表1 PKH標記前后髓核細胞增殖情況比較（n=3，±s）

均P＞0.05

組別PKH26標記組未標記組t 1 d 0.27±0.06 0.24±0.05 0.663 2 d 0.71±0.11 0.63±0.08 1.019 3 d 1.03±0.10 1.19±0.13 1.690 4 d 1.79±0.09 1.70±0.18 0.775組別PKH26標記組未標記組t 7 d 1.97±0.24 1.89±0.27 0.384 5 d 2.01±0.17 1.92±0.14 0.708 6 d 1.95±0.21 2.10±0.15 1.007

Fig.5 Comparison of gene expressions of nucleus pulposus cells before and after PKH26 labeling圖5 髓核細胞PKH26標記前后基因表達水平比較

3 討論

3.1 髓核細胞來源 髓核細胞作為種子細胞，目前主要來源于患者手術切除組織和兔[4]、鼠[5]等小動物。而小動物存在以下不足：首先，獲取髓核組織量少，不能得到理想的種子細胞數目；其次，小動物與人的親緣關系不如大型動物；用于研究的人髓核細胞都來源于患者手術中切除的退變組織，分離的細胞沒有正常髓核細胞的表型，不能滿足研究的需要[6]。牛尾取材經濟、方便，能一次性獲取大量的髓核組織。Roughley等[7]從成年牛尾中獲得細胞數為3×106/g。Halloran等[8]從6月齡牛尾中提取的細胞數約為7.0×106/g。不同實驗者獲取的種子細胞數目存在較大差異，這主要與牛的年齡有關。本實驗獲取的種子細胞數在文獻所報道的范圍內，能夠滿足種子細胞的數量要求。目前對于髓核細胞的鑒定沒有統一的方法，但由于髓核細胞是一種軟骨樣細胞，能夠分泌蛋白多糖和Ⅱ型膠原，通過這兩個表型特點來初步鑒定髓核細胞，并且染色均為陽性，說明牛尾髓核組織可以獲得數量和表型均滿意的髓核種子細胞。

3.2 熒光標記技術 目前常用的細胞標記染料包括Brdu[9]、CFSE[10]、綠色熒光蛋白[11]、PKH26[12]、放射性同位素標記[13]等。其中，PKH26是一種親脂性的熒光染料，熒光顯微鏡下呈現紅色熒光，能夠不可逆地結合細胞膜，在合適的濃度下不會影響細胞活力，標記物可以隨著種子細胞的分裂而均勻地分配給兩個子細胞，同時熒光強度減半，是一種簡便的體內細胞示蹤染料，在體內熒光強度可以維持4個月，已成功用于上皮細胞[12]、骨髓基質干細胞[14]等的熒光標記。

3.3 PKH標記牛尾髓核細胞 本實驗PKH26標記采用Sigma公司推薦的標記濃度（2 μmol/L）成功對牛尾髓核細胞進行了標記，熒光顯微鏡下強度滿意，熒光標記均勻，且標記后的細胞活性基本沒有影響（2 μmol/L濃度下，標記時間一般在2～3 min，延長時間細胞熒光強度沒有明顯增強，而細胞活性會受到影響），細胞標記前后MTT增殖檢測、同一基因相對表達量比較也無明顯差異。傳代培養14 d、28 d細胞熒光逐漸減弱，但是仍可檢測出，這說明PKH26標記的細胞體內可以至少維持1個月，這為髓核組織工程體內研究提供了新的研究方法，可以對種子細胞進行示蹤，根據熒光定位區分移植細胞和宿主細胞，結合免疫熒光可以更準確地對種子細胞體內生物學功能進行評估。

綜上，從牛尾髓核組織可以獲得數量和表型均滿意的髓核種子細胞，經PKH26標記后，牛尾髓核細胞形態、表型、增殖及蛋白表達無影響，而且PKH26標記技術操作簡單，標記迅速、持續時間長，可以用作組織工程椎間盤種子細胞的示蹤研究。

Fig.3 The staining for nucleus pulposus cells of P1(inverted phase contrast microscope，×200)圖3 P1代髓核細胞鑒定染色（倒置相差顯微鏡，×200）

Fig.4 PKH26 labeled nucleus pulposus cells(fluorescence microscope，×100)圖4 PKH26標記的髓核細胞（熒光顯微鏡，×100）

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（2014-04-28收稿 2014-05-23修回）

（本文編輯 李鵬）

An Experimental Study on Bovine Nucleus Pulposus Cells Labelled with PKH26 in Vitro

DING Xiaoming1，XU Baoshan2△，WU Yaohong1，XU Haiwei2，YANG Qiang2，MA Xinlong2，ZHANG Chunqiu3，LI Xiulan2，ZHANG Yang2
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Tianjin Hospital；3 Tianjin University of Technology△

E-mail：xubaoshan99@126.com

ObjectiveTo investigate the application of PKH26 fluorescent labeling on nucleus pulposus cells isolated from bovine coccyx disc,and to provide nucleus pulposus tissue engineering with traceable nucleus pulposus cells by PKH26 fluorescence labelling.MethodsNucleus pulposus primary cells were isolated from the nucleus pulposus tissue detached from bovine coccyx disc by enzymatic digestion,and observed under the inverted microscope.Safranin O,toluidine blue and typeⅡcollagen immunocytochemistry methods used to stain for passage one generation cells.Nucleus pulposus cells were labeled with PKH26 fluorescence in accordance with the instructions.The cell activity,fluorescence intensity at d0,d14 and d28 of culture,characteristics of proliferation and the expression of gene in labeled cells were assessed.ResultsIsolated nucleus pulposus cells amounted to(1.56±0.35)×106/g.Under the inverted microscope,primary cells adhered at the 4 th day of culture,grew in groups,and covered the bottom of culture flask at the 13 th day.Both primary cells and the P1 generation cells were chondrocyte-like morphology.The staining of safranin O,toluidine blue and typeⅡcollagen immunocytochemistry for P1 generation of nucleus pulposus cells showed positive results.The cell activity before and after PKH26 labeling showed more than 95％,and the fluorescence intensity at d0,d14 and d28 performed a decreasing trend, but still showed detect strong fluorescence at d28.There were no significant differences in proliferation and the expression of gene(collagen typeⅠandⅡ,aggrecan)before and after cell labeling(P＞0.05).ConclusionAs the seed cells of tissue engineering,nucleus pulposus cells isolated from bovine coccyx can reach a satisfactory number and maintain cartilage-like phenotype,and no changes shown in the biological characteristics after labeling.PKH26 labeled nucleus pulposus cells are suitable for the traceable cells in vivo study.

tissue engineering；intervertebral disk；bovine coccyx;nucleus pulposus cells;PKH26

R329-33，R349.89

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.001

國家自然科學基金資助項目（81272046,31300798,31000432）；中國博士后科學基金項目（2011M500530,2012T50221)；天津市衛生局科技基金（2013KR16）

1天津醫科大學研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫院；3天津理工大學

△通訊作者 E-mail：xubaoshan99@126.com