一種新型診斷和治療肝移植術后缺血型膽道病變模式的研究

張英才 劉劍戎 許世磊 楊卿 任杰 鄭榮琴 楊揚 陳規(guī)劃

隨著器官保存液、免疫抑制劑、外科手術技術和圍手術期管理技術的改善，肝移植術后感染和排斥反應等常見并發(fā)癥逐漸減少，術后受者和移植肝的生存率顯著提高。但膽道并發(fā)癥的發(fā)生率卻未能明顯下降，成為影響移植肝長期存活的重要因素。移植肝缺血型膽道病變(ischemic-type biliary lesions，ITBLs)已成為肝移植術后最難處理的膽道并發(fā)癥之一。ITBLs 是指非手術吻合造成的膽管樹破壞、狹窄或梗阻，不伴動脈血栓形成。由于不同的研究對其定義可能存在不同，ITBLs 發(fā)生率為5% ～15%［1-6］，甚至有報道其發(fā)生率高達26%［7-8］，ITBLs 已成為再次肝移植的主要原因之一。目前傳統(tǒng)診斷ITBLs 的方法主要依靠介入影像學方法，例如磁共振胰膽管造影(magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP)、經內鏡逆行胰膽管造影(endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP)以及經皮肝穿刺膽道造影(percutaneous transhepatic cholangiodrainage，PTCD)等。這些方法在診斷和治療ITBLs 方面存在嚴重的滯后性，治療效果較差，很多出現ITBLs 的受者只能求助于再次肝移植。因此尋找一種早期預測和診斷ITBLs 的方法具有重要的意義。中山大學附屬第三醫(yī)院肝臟移植中心從2007 年2 月起采用早期診斷與干預模式(early diagnosis and intervention model，EDIM)診斷和治療肝移植術后ITBLs，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2003 年10 月至2012 年6 月我中心行原位肝移植術后出現ITBLs 的受者(所有的入選受者均接受尸體供肝)。入選標準:(1)經ERCP 或PTCD 檢查明確診斷為ITBLs;(2)受者依從性好，可規(guī)律隨訪，病歷資料完整。排除標準:(1)供、受者血型不相合;(2)術后出現肝動脈血栓形成;(3)原發(fā)疾病為原發(fā)性硬化性膽管炎。共納入80 例受者。2003 年10 月至2007 年1 月接受傳統(tǒng)模式診療的受者作為傳統(tǒng)模式組，2007 年2 月至2012 年6 月接受EDIM 診療的受者作為EDIM 組。其中，傳統(tǒng)模式組37 例(男性32 例，女性5 例)，中位年齡49. 7 歲(26 ～70)歲;EDIM 組43 例(男性37 例，女性6 例)，中位年齡46.6 歲(29 ～62)歲。所有受者接受常規(guī)隨訪，截至2013 年12 月，傳統(tǒng)模式組和EDIM 組受者中位隨訪時間分別為76.2 個月(13 ～118 個月)和53.4 個月(18 ～80 個月)。研究對象均簽署知情同意書，研究內容經本院倫理審查委員會審批通過。

1.2 傳統(tǒng)模式組和EDIM 組的ITBLs 診斷及治療模式

傳統(tǒng)模式組受者出現膽道酶學改變(如總膽紅素、谷氨酰轉肽酶升高)，同時出現發(fā)熱、黃疸及腹痛等癥狀時，首先給予熊去氧膽酸、腺苷蛋氨酸及前列腺素E1 等藥物處理，效果不佳時則行MRCP、ERCP 或PTCD 等檢查。明確診斷為ITBLs 后，根據情況行介入(包括PTCD、ERCP 和肝動脈支架植入術)或手術等治療，以上治療無效者則行再次肝移植。

EDIM 組受者預防性給予上述藥物治療。術后1 個月內每周接受1 次膽道超聲造影(contrastenhanced ultrasound，CEUS)檢查。1 個月后，根據肝功能情況調整CEUS 檢查次數。生化檢查發(fā)現膽道酶學異常，同時CEUS 發(fā)現肝門膽管壁在動脈期為低增強或無增強，甚至出現肝內膽管擴張、肝門膽管狹窄及管壁增厚等改變時，提示移植肝出現ITBLs。行人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)移植，以改善膽道供血和修復膽道上皮，同時行PTCD、ERCP 或MRCP明確診斷并引流膽汁。如果介入治療效果欠佳，根據情況行局部肝切除和(或)肝腸吻合術，以上治療無效者則行再次肝移植。

1.3 膽道CEUS 檢查

采用Acuson Sequoia 512 型超聲診斷儀(美國西門子公司)，4V1 凸陣探頭，頻率1.0 ～4.0 MHz。成像技術采用對比脈沖序列，機械指數0. 15 ～0.21。造影劑采用SoneVue(意大利Bracco 公司)聯合5 mL 生理鹽水配制成六氟化硫微泡懸浮液，肘部淺靜脈注射造影劑1.5 mL/次，可重復多次注射。

1.4 HUMSCs 制備和移植

選取中山大學附屬第三醫(yī)院產科出生的正常足月健康嬰兒臍帶組織，浸泡于DMEM 培養(yǎng)基中，超凈環(huán)境下去除多余組織，剪碎為1 mm ×1 mm ×1 mm 的組織塊。將組織塊移至0.1%Ⅰ型膠原酶中，加入少許DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃恒溫振蕩儀內消化，直至Wharton 膠全部消化。將含細胞的消化液吸入無菌離心管，以30 倍體積DMEM 培養(yǎng)液反復吹打稀釋，300 × g 離心5 min，棄上清液。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸浮后轉移至普通培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。細胞貼壁后，第3 天首次換液，棄去未貼壁細胞，以后每3 或4 天換液1 次，第2 次換液起使用原培養(yǎng)基和MesenPro 減血清培養(yǎng)基(1 ∶1 比例混合)培養(yǎng)。常規(guī)消化、傳代。

EDIM 組受者在CEUS 初步診斷膽道供血不佳，懷疑出現ITBLs 時，即開始應用HUMSCs 移植。具體方法為:分別在初步診斷0，1，2，4，8，12 周后，經外周靜脈輸注1 ×106個/kg 劑量的HUMSCs。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差(ˉx ±s)表示。采用t 檢驗比較兩組受者初診為ITBLs 的時間、采取介入治療的時間及移植肝丟失時間。采用Kaplan-Meier 曲線和Log-Rank 法分析兩組受者移植肝生存率。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 傳統(tǒng)模式組和EDIM 組受者ITBLs 診斷情況

ITBLs 受者CEUS 檢查可見肝門部膽管壁在動脈期為低增強或無增強，提示膽道血供欠佳;彩色B 超檢查可見肝內膽管不均勻擴張、肝門部膽管狹窄及管壁增厚等聲像(圖1)。非ITBLs 受者CEUS檢查可見膽總管壁在動脈期增強明顯(高于肝實質)，在門靜脈期和延遲期持續(xù)處于等或低增強，提示膽道血供良好;彩色B 超檢查可見膽管腔輪廓清晰(圖2)。

圖1 缺血型膽道病變受者移植肝膽道影像學檢查

圖2 非缺血型膽道病變受者移植肝膽道影像學檢查

傳統(tǒng)模式組受者從肝移植術后到確診ITBLs 的平均時間為(56±31)d，EDIM 組受者為(24 ±19)d，兩組比較差異有統(tǒng)計學差異(t =5.136，P ＜0.05)。傳統(tǒng)模式組從確認ITBLs 到采用介入治療的平均時間為(105 ±42)d，而EDIM 組僅為(58 ±20)d，兩組比較差異有統(tǒng)計學差異(t=7.035，P ＜0.05)。

2.2 傳統(tǒng)模式組和EDIM 組受者ITBLs 治療效果及隨訪結果

傳統(tǒng)模式組37 例受者中，18 例經藥物和介入治療后病情好轉，肝功能長期穩(wěn)定;2 例介入治療效果不佳，行肝段切除+膽腸吻合后病情好轉;11 例經介入或手術治療無效后行再次肝移植(1 例術中出血較多，術后多器官功能衰竭死亡;1 例移植術后發(fā)生移植物抗宿主病死亡);6 例經介入或手術治療無效，但未及時行再次肝移植而死亡。EDIM 組43 例受者中，25 例經藥物、HUMSCs 移植和介入治療后病情好轉，肝功能長期穩(wěn)定;3 例在上述治療效果不佳后行肝段切除+膽腸吻合后病情好轉;9 例經介入和手術等治療無效后行再次肝移植(1 例術后發(fā)生嚴重感染死亡);6 例經介入或手術治療無效，但未及時行再次肝移植而死亡。

所有受者均接受常規(guī)隨訪，截至2013 年12 月，傳統(tǒng)模式組和EDIM 組受者中位隨訪時間分別為76.2 個月(13 ～118 個月)和53. 4 個月(18 ～80 個月)。傳統(tǒng)模式組和EDIM 組死亡受者分別為8 例和7 例。傳統(tǒng)模式組移植肝1，3 年生存率分別89.2%，54.1%，EDIM 組移植肝1，3 年生存率分別95.3%，81.3%，傳統(tǒng)模式組受者移植肝1，3 年生存率均低于EDIM 組(χ2=4.219，P ＜0.05)，見圖3。傳統(tǒng)模式組和EDIM 組移植肝丟失的時間分別為(25 ±9)個月和(33 ±10)個月，傳統(tǒng)模式組出現移植肝丟失時間早于EDIM 組(t = － 2. 085，P ＜0.05)。

圖3 傳統(tǒng)模式組和早期診斷與干預模式組移植肝生存時間比較

3 討 論

ITBLs 的診斷和治療一直都是肝移植術后的一大挑戰(zhàn)，目前肝移植術后診斷ITBLs 主要依靠MRCP、ERCP 及PTCD 等膽道造影檢查［4-5，9-11］。其中，無創(chuàng)性的MRCP 逐漸成為診斷ITBLs 的首選方法，其靈敏度和特異度均較高［12-14］。Boraschi 等［12］報道，MRCP 診斷肝移植術后膽道并發(fā)癥的靈敏度為93%，特異度為92%，陽性預測值為86%，陰性預測值為96%，效果較佳。MRCP 可發(fā)現膽管樹扭曲變形、肝內膽管擴張、膽泥形成、膽管壁破壞等改變。但出現這些形態(tài)學改變的患者基本已處于疾病的進展期，失去了治療的最佳時機。ERCP 和PTCD是目前公認診斷ITBLs 的金標準，但這兩種方法均為有創(chuàng)性檢查，引起胰腺炎或出血的發(fā)生率為1% ～7%［15-16］。因此，以上方法均不能用于早期監(jiān)測和診斷肝移植術后ITBLs，尋找一種無創(chuàng)的、早期診斷ITBLs 的方法顯得尤為重要。

CEUS 將具有與人體組織不同聲學特性的超聲對比劑注入人體，增強血流及組織的回聲對比。動物實驗和臨床試驗均證實超聲對比劑的注入可彌補彩色多普勒超聲在顯示深部血管、低速微弱的血流信號方面的不足，可使超聲成像的信噪比顯著提高，并可檢查微末級小血管的血流信號。CEUS 所用的對比劑與CT、MRI 不同，它無法穿過微血管內皮間隙，因此可以對組織微循環(huán)顯示的更為清楚可靠［17］。因此，CEUS 在診斷肝移植術后肝動脈和門靜脈并發(fā)癥方面顯示出巨大的價值，極大地減少了血管造影等有創(chuàng)性檢查方法的應用［18-21］。但目前關于CEUS 在診斷肝移植術后膽道并發(fā)癥，特別是ITBLs 方面的研究極少。事實上，ITBLs 本質上也是一種血管源性并發(fā)癥。膽管基本完全依靠肝動脈在膽管周圍形成的血管叢供血，ITBLs 的病理基礎之一即為膽管周圍血管叢損傷造成膽管微循環(huán)改變引起的膽管上皮壞死、纖維化和狹窄［8，22-24］。利用CEUS 監(jiān)測肝移植術后膽管周圍血管叢微循環(huán)的改變情況可能成為早期診斷ITBLs 的一種有效方法。

我們發(fā)現，ITBLs 與非ITBLs 受者在CEUS 檢查時的肝門部膽管增強表現有顯著差異。CEUS 動脈期，ITBLs 患者肝門部膽管壁對比劑注入少，呈無或低增強;非ITBLs 患者該部位對比劑注入多，呈高或等增強。這種CEUS 表現的不同反映了ITBLs 膽管周圍血管叢受損、膽管灌注水平下降的病理改變，有助于在膽管出現形態(tài)學改變之前早期診斷ITBLs［25］。此外，CEUS 還可發(fā)現肝內膽管擴張、肝門部膽管狹窄、管壁增厚等變化。因此，結合CEUS和膽道酶學結果，我們可以在膽道功能學改變階段實現ITBLs 的早期診斷。

除了早期診斷ITBLs，我們對治療模式也進行了一些探索。傳統(tǒng)治療模式上存在嚴重的滯后性，從肝移植術后到確診ITBLs 再行介入或手術干預的時間一般需要3 ～5 個月，此時已有很多受者出現不可逆性膽管損傷。Hertl 等［26］以豬作為實驗對象，發(fā)現用含疏水性膽鹽的鹽水灌注的肝臟移植術后肝內膽管損傷明顯加重。Hoekstra 等［27］采用轉基因小鼠模型證實肝內膽汁淤積和膽鹽潴留是引發(fā)移植肝損傷的關鍵機制。在人體肝移植術后也發(fā)現膽管損傷與毒性膽汁形成有關，其特點是膽汁中膽鹽/磷脂的比例較高［28］。膽汁淤積還容易引起細菌生長、導致膽道感染的發(fā)生率升高。受以上研究啟示，我們認為早期預防膽汁淤積并采用介入手段保持膽汁引流通暢，對膽管上皮具有重要的保護意義。因此，我們在肝移植術后即給予受者口服熊去氧膽酸和腺苷蛋氨酸預防膽汁淤積和膽結石形成，同時靜脈滴注前列腺素E1 以改善膽管微循環(huán)，減輕膽管上皮細胞的損傷。每周1 次膽道CEUS 檢查顯著縮短了ITBLs 的初診時間。

另外，由于組織器官發(fā)生炎癥時會釋放一些細胞黏附因子和趨化因子，可與干細胞的有關受體相互作用，從而對間充質干細胞產生趨化性。間充質干細胞的這種向病灶趨化遷移能力對治療一些急性組織損傷具有重要意義。研究表明，間充質干細胞可減輕肝移植免疫性損傷，有效延長移植物和受體生存期，并參與移植肝的組織修復;其具體機制尚不清楚，可能涉及間充質干細胞的趨化性、分泌的肝細胞生長因子及其轉分化作用［29-32］。受這些研究啟發(fā)，我們對肝移植術后出現ITBLs 的受者應用HUMSCs 移植治療，在初步的臨床研究中發(fā)現，HUMSCs 移植可使部分ITBLs 受者保持長期的肝功能穩(wěn)定，推遲或避免了再次肝移植手術。

與傳統(tǒng)診治模式比較，早期診斷和干預ITBLs的新型模式可以減輕膽管的損傷，降低膽道感染的發(fā)生率，延長術后移植肝的存活時間，延遲移植肝丟失時間，提高ITBLs 的整體治療效果。

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