腎動(dòng)脈內(nèi)套法建立大鼠腎移植模型

曾啟洪 朱毅 葉少軍 周威 邵明杰 李偲 明英姿

大鼠模型是器官移植實(shí)驗(yàn)研究中常用的動(dòng)物模型之一，廣泛應(yīng)用于腎移植及免疫學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究［1-3］。目前，國(guó)內(nèi)外建立大鼠腎移植模型的手術(shù)方法有多種［4-6］，但大部分方法操作復(fù)雜、難度高且成功率低，一定程度上限制了大鼠腎移植模型的推廣應(yīng)用。本研究成功建立了一種構(gòu)建大鼠腎移植模型的新方法，具有手術(shù)操作簡(jiǎn)單及成功率高的特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD 大鼠24 只，成年雄性Wistar 大鼠48 只，體質(zhì)量300 ～350 g，12 ～15 周齡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體環(huán)境。SD 大鼠作為供體，術(shù)前正常飲食。Wistar 大鼠作為受體，術(shù)前禁食(不禁水)12 h。供體大鼠接受左側(cè)原位腎移植，自體右腎于術(shù)中切除。

1.1.2 手術(shù)器械及藥品

手術(shù)器械:顯微外科手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)、冷光單孔手術(shù)燈(江蘇醫(yī)邦醫(yī)療器械科技有限公司)、手術(shù)放大鏡(天津醫(yī)用光學(xué)儀器廠)、電動(dòng)剃毛器(海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司)、醫(yī)用10-0、11-0無(wú)損傷縫合線及醫(yī)用0 號(hào)絲線(上海醫(yī)用縫合針廠)。

套管制備:利用正壓無(wú)針連接式留置針(蘇州林華醫(yī)療)制備套管，針頭用于制備動(dòng)脈套管(直徑0.6 mm，長(zhǎng)2 mm)，套管側(cè)壁剪開(kāi)。透明管道用于制備靜脈套管(直徑1.5 mm，長(zhǎng)3 mm)。外包裝透明塑料片用于制備撐開(kāi)器(5 cm×1 cm)。

實(shí)驗(yàn)藥品:10% 水合氯醛(西安悅來(lái)醫(yī)藥科技)、肝素鈉(南京新百藥業(yè)有限公司)、0.9%氯化鈉注射液及5%葡萄糖注射液(湖南科倫制藥有限公司)、頭孢米諾(1 g/支，海南衛(wèi)康制藥有限公司)、離體供腎保存用枸櫞酸鹽嘌呤溶液(上海長(zhǎng)征醫(yī)院)。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 供體大鼠手術(shù)

SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.0 mL/kg)行誘導(dǎo)麻醉，麻醉起效后，取仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上。電動(dòng)剃毛器剃去腹部毛發(fā)，絡(luò)合碘消毒后，沿腹部正中切口切開(kāi)皮膚，切口范圍從劍突到恥骨聯(lián)合，自制拉鉤拉開(kāi)雙側(cè)皮膚，充分暴露手術(shù)視野。將腸管用溫濕生理鹽水(25 ℃～35 ℃)紗布包裹并置于大鼠右側(cè)，游離腹主動(dòng)脈及后腔靜脈間脂肪囊。鈍性分離腹主動(dòng)脈，結(jié)扎前腸系膜動(dòng)脈，于腹主動(dòng)脈與前腸系膜動(dòng)脈分叉處上方留置絲線，暫不拉緊，打一松結(jié)備用，繼續(xù)向下游離至髂總動(dòng)脈分叉處，絲線結(jié)扎。游離后腔靜脈，上至肝下后腔靜脈，下至髂腰靜脈分叉處，絲線結(jié)扎。充分暴露左腎及左腎動(dòng)、靜脈，先游離膀胱及輸尿管至腎門，注意保留周圍滋養(yǎng)血管及脂肪組織，鈍性分離左腎動(dòng)、靜脈，分別結(jié)扎精索內(nèi)靜脈及腎上腺靜脈，采用相同方法游離右腎及右腎輸尿管。在腹主動(dòng)脈上端拉緊留置絲線，將灌注針插入腹主動(dòng)脈，同時(shí)將后腔靜脈靠近結(jié)扎處剪一破口，勻速灌注含肝素鈉的枸櫞酸鹽嘌呤溶液(400 U/mL)，直至雙腎顏色變灰白色、腎靜脈流出液變澄清。剪斷腹主動(dòng)脈兩端結(jié)扎處、于后腔靜脈結(jié)扎處及肝下后腔靜脈結(jié)扎處，平均剪斷腹主動(dòng)脈及后腔靜脈，分離出雙腎輸尿管及膀胱，放入4 ℃生理鹽水保存。

1.2.2 供腎修整

將供腎置于4 ℃生理鹽水中進(jìn)行修整，盛有供腎的器皿置于無(wú)菌冰塊中保持低溫。借助手術(shù)放大鏡，游離腎動(dòng)、靜脈壁上脂肪組織，注意腎門區(qū)脂肪組織盡量保留。腎動(dòng)脈處修剪為保留腹主動(dòng)脈瓣的圓形瓣口，腎靜脈處修剪為保留后腔靜脈的T 形血管，以輸尿管口為中心剪一直徑約0.5 cm 的圓形膀胱瓣，修整完畢，繼續(xù)低溫保存。

1.2.3 受體大鼠手術(shù)

受體Wistar 大鼠接受左側(cè)原位腎移植，自體右腎于術(shù)中切除。術(shù)前麻醉、消毒同前，取腹部正中切口，上至劍突，下至膀胱，自制拉鉤拉開(kāi)皮膚。溫濕生理鹽水紗布包裹腸管并置于大鼠右側(cè)，自制撐開(kāi)器充分暴露左腎，游離左腎動(dòng)、靜脈。結(jié)扎左腎上腺靜脈及左精索內(nèi)靜脈，于腎門區(qū)結(jié)扎左輸尿管，在腎動(dòng)、靜脈近心端用血管夾夾閉，切除左腎。含肝素鈉的生理鹽水沖洗受體腎動(dòng)、靜脈殘端，將供腎置入左腎窩，覆蓋薄棉球及冰屑，保持低溫。借助手術(shù)放大鏡，先將自制動(dòng)脈套管置入供腎動(dòng)脈內(nèi)，在受體腎動(dòng)脈壁一側(cè)以11-0 線縫合打結(jié)1 針，針頭沿套管穿入供腎動(dòng)脈并穿出，另一針頭同法穿出，兩針穿出點(diǎn)盡量靠近，退出套管，完成腎動(dòng)脈壁一側(cè)的吊線(圖1a)。將受體腎動(dòng)脈牽入供腎動(dòng)脈，拉緊縫合線并打結(jié)(圖1b)。供腎動(dòng)脈瓣與受體動(dòng)脈外膜固定3 針(圖1c)。受體腎靜脈與供體后腔靜脈近心端吻合(圖1d)，自供體后腔靜脈遠(yuǎn)心端插入自制靜脈套管，近心端穿出，將供體后腔靜脈內(nèi)近心端側(cè)套管套入受體腎靜脈內(nèi)，2 根10-0 線分別固定2 個(gè)點(diǎn)，雙側(cè)連續(xù)縫合并打結(jié)(圖1e)，縫合完畢退出套管，同時(shí)結(jié)扎供體后腔靜脈遠(yuǎn)心端(圖1f)。結(jié)扎前向管腔內(nèi)注入含肝素鈉的生理鹽水，先開(kāi)放動(dòng)脈后開(kāi)放靜脈，棉球壓迫止血，溫鹽水復(fù)溫，移植腎顏色紅潤(rùn)，輸尿管膀胱瓣口可見(jiàn)尿液流出(圖2)。將受體膀胱修剪一瓣口，同供體膀胱瓣口大小，并以10-0 線間斷縫合8 針。縫合完畢后檢查有無(wú)出血及漏尿，將受體脂肪囊包裹固定移植腎，依據(jù)出血量情況從髂腰靜脈適當(dāng)補(bǔ)充20 ℃含肝素鈉的5%葡萄糖溶液。分離右腎，沿右腎腎門切除右腎并絲線結(jié)扎，腹腔內(nèi)注入頭孢米諾10 mg，關(guān)腹。

1.2.4 術(shù)后處理

受體大鼠術(shù)后燈照保溫1 h，蘇醒后放入籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，并喂食5%葡萄糖溶液。術(shù)后第1 天恢復(fù)正常飲食，并鼻飼他克莫司0.1 mg/kg，1 次/d。死亡受體大鼠行常規(guī)尸檢探查［7］。

1.3 觀察指標(biāo)

以受體大鼠術(shù)后存活3 d 為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)［8］。記錄手術(shù)時(shí)間及缺血時(shí)間，觀察受體大鼠術(shù)后存活情況。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)時(shí)間及缺血時(shí)間

本研究共實(shí)施48 例大鼠腎移植術(shù)。24 只供體大鼠平均手術(shù)時(shí)間(35±6)min，供腎修整時(shí)間(3.9±1.2)min。供腎熱缺血時(shí)間(5.7±1.5)s，冷缺血時(shí)間(52 ±6)min。受體大鼠平均手術(shù)時(shí)間(39±6)min，動(dòng)脈吻合時(shí)間(6.9±2.5)min，靜脈吻合時(shí)間(14.2±2.3)min，尿路重建時(shí)間(6.6 ±1.1)min。

圖2 供腎移植成功后，輸尿管膀胱瓣口可見(jiàn)尿液流出

圖1 受體大鼠腎動(dòng)、靜脈吻合要點(diǎn)

2.2 受體大鼠存活情況

48 只受體大鼠中位存活時(shí)間為6 d。術(shù)后3 d內(nèi)，2 只大鼠因血管吻合口出血死亡，2 只因移植腎動(dòng)脈內(nèi)血栓形成死亡，1 只因尿瘺致腹膜炎死亡，其余43 只大鼠均獲手術(shù)成功，成功率89.6%。截至術(shù)后14 d，共7 只受體大鼠存活。

3 討 論

大鼠具有經(jīng)濟(jì)、便于飼養(yǎng)、體型適宜以及易于實(shí)施手術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，因此大鼠腎移植模型是腎移植及免疫耐受等研究的首選動(dòng)物模型。盡管大鼠腎移植模型有許多優(yōu)點(diǎn)，但這一模型的應(yīng)用還是受到限制，主要原因?yàn)榻＿^(guò)程尤其是血管重建過(guò)程需要難度較大的顯微外科技術(shù)，對(duì)于非顯微外科專業(yè)的初級(jí)外科醫(yī)生或從事實(shí)驗(yàn)研究的科研人員，難以完成這些操作［9］。

目前建立大鼠腎移植模型的手術(shù)方式有多種，其中血管重建的方法有:端－端吻合法［10］、端－側(cè)吻合法［11］、袖套法吻合法［12］和Cuff 套管吻合法［13］，以前二者應(yīng)用最廣泛。本研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)近1 年的研究，對(duì)多種手術(shù)方式進(jìn)行了嘗試、比較，并對(duì)術(shù)中的某些操作進(jìn)行了改進(jìn)，摸索出一種操作簡(jiǎn)便、易于掌握、術(shù)后存活率較高的大鼠腎移植模型建立方法。本研究采用腎動(dòng)脈內(nèi)套法(受體腎動(dòng)脈內(nèi)套入供體腎動(dòng)脈)重建腎動(dòng)脈，受體腎靜脈與供體后腔靜脈近心端行端－端吻合，供體輸尿管膀胱瓣與受體膀胱吻合進(jìn)行尿路重建。腎動(dòng)脈內(nèi)套法有以下優(yōu)點(diǎn):(1)不需要阻斷體循環(huán)，對(duì)大鼠其他臟器影響較小;(2)降低了手術(shù)難度，不需要顯微鏡下操作，無(wú)需考慮動(dòng)脈吻合閉塞;(3)借助自制動(dòng)脈套管，使動(dòng)脈套入相對(duì)簡(jiǎn)單，縫線固定及3 點(diǎn)外膜加固使得動(dòng)脈吻合良好。

在構(gòu)建大鼠腎移植模型的過(guò)程中，本中心有以下心得體會(huì):(1)腎動(dòng)脈內(nèi)套法成功的關(guān)鍵在于供腎動(dòng)脈必須保持血流通暢，需在修腎及置入套管前驗(yàn)證;(2)因靜脈壁較薄，腎靜脈吻合時(shí)易出現(xiàn)前后壁的縫閉，而通過(guò)后腔靜脈置入導(dǎo)管，可發(fā)揮支架作用，使靜脈吻合非常便捷;(3)靜脈吻合完畢需拔出套管并注入含肝素鈉的生理鹽水預(yù)防空氣栓塞，同時(shí)可以檢查是否存在吻合口瘺;(4)開(kāi)放血供后若有出血，用棉球輕壓出血點(diǎn)即可，必要時(shí)可補(bǔ)針;(5)若移植腎灌注不佳，可以通過(guò)髂腰靜脈補(bǔ)充少量含肝素鈉的生理鹽水;(6)腎移植成功后，建議立即切除自體右腎，因行二期手術(shù)切除右腎會(huì)增加手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和死亡率，且體外留線結(jié)扎法會(huì)增加感染機(jī)會(huì)，右腎缺血壞死亦會(huì)增加受體死亡率。

大鼠腎移植模型的成功建立依賴于簡(jiǎn)便的操作方法、較短的手術(shù)時(shí)間以及對(duì)其他臟器功能的較小影響。本研究報(bào)道的腎動(dòng)脈內(nèi)套法滿足上述要求，初學(xué)者能快速掌握，可為今后大鼠腎移植模型的研究提供參考。

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