通過性腺形狀和顏色鑒定紅鰭東方鲀的性別

孫賽紅+王玉芳+姜志強+仇雪梅+王秀利

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.004

摘 要：：隨機采集體長18～20 cm、體重200～250 g的紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）44尾，解剖觀察并記錄性腺組織外觀，然后利用組織切片技術鑒定個體的性別。結果表明：性腺為細長條狀且呈乳白色的個體為雄性個體，而性腺為袋狀且呈淡紅色的個體為雌性個體，且樣本群體中的雌雄性別比例為1∶1。本研究結果為通過性腺外觀形狀和顏色即可準確鑒定體長為20 cm左右的紅鰭東方鲀的性別提供了參考依據。

關鍵詞：紅鰭東方鲀；性別鑒定；性腺形狀和顏色；組織切片技術

紅鰭東方鲀 主要分布于中國的黃渤海和日本海。由于其特殊的營養價值和鮮美的味道，紅鰭東方鲀一直深受中國、日本和韓國等人民的喜愛[1]。近年來，人們不斷開發利用紅鰭東方鲀，對它的研究也越來越多樣化。

性別鑒定技術在紅鰭東方鲀乃至整個魚類的種群資源保護和增養殖方面具有重要作用。目前性別鑒定的方法主要有熒光原位雜交（FISH）、組織切片技術、多聚酶鏈式反應（PCR）和AFLP分子標記等，它們已在哺乳動物和魚類的性別鑒定中得到了廣泛的應用。部分養殖魚類的生物學性狀（如成熟年齡、繁殖方式、體色、體型、個體大小）在雌雄魚之間存在較大差異，便于區分。然而，在非繁殖季節，紅鰭東方鲀卻沒有明顯的雌雄外部特征，所以，對其雌雄的鑒別以及性腺發育階段的區分較為困難。尤其對于某些研究，例如對于需做紅鰭東方鲀不同性別不同組織器官的差異表達等研究時，前述的分子生物學方法的過程略顯繁瑣，故急需找到更簡單、明了、準確的性別判定法。通過觀察發現，對于非繁殖季節的紅鰭東方鲀，其性腺外觀一種表現為袋狀，且顏色淡紅，而另一種表現為長條狀，呈乳白色。本研究采用組織切片技術[2]進行分析以發現雌雄性腺外觀的客觀差別和規律。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紅鰭東方鲀采自大連天正實業有限公司，共采集44尾。體長為18～20 cm，體重為200～250 g。

1.2 試劑

無水乙醇、二甲苯、苦味酸、甲醛、酸水、堿水、蘇木精伊紅染液、甘油蛋白、中性樹膠、高級切片石蠟等試劑和藥品來自大連海洋大學基因工程實驗室。

1.3 儀器

烘箱、切片機（LEICA RM 2235）、顯微鏡（LEICA DM 2000）和烘片機（LEICA HI 1220）等。

1.4 方法

解剖紅鰭東方鲀，觀察性腺形狀和顏色。按叢玉婷、唐洪玉、梁春光和戴奇等[2-5]方法制作組織切片。

1.4.1 固定、脫水、透明 取性腺于bouin氏固定液中固定24 h后，每隔2 h、4 h、6 h、12 h、24 h換一次70%乙醇，洗去滲入組織內部的固定劑；然后將洗滌好的樣品用酒精梯度（70%、80%、90%、95%、100%）依次脫水，每次35～45 min，除去組織內含有的大量水分；1/2無水乙醇和1/2二甲苯作用30 min，二甲苯作用15 min置換出組織內的脫水劑至組織塊完全透明。

1.4.2 包埋、滲蠟、切片 石蠟融化后，將組織塊置于含1/2二甲苯和1/2石蠟的小瓶子滲透30 min，然后在純石蠟中滲透40 min，純石蠟再次滲透30 min；將紙片疊成盒狀，倒上融化好的石蠟，然后把滲好蠟的組織塊放入盒中間，待蠟凝固；把凝固的蠟塊修成適合大小，固定于切片機上，切片；取較好的切片挑在事先涂少許甘油蛋白和蒸餾水的載玻片上展片，于烘干機上烘干水分。

1.4.3 染色 首先脫蠟，二甲苯脫蠟15 min，換新的二甲苯再次脫蠟15 min；然后降水，100%乙醇 I、100%乙醇 II、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、H2O依次降水2 min；蘇木精染液著色10 min，自來水沖洗5 min；1%鹽酸酸化5 s，水洗3 min；1%氨水藍化5 s，水洗3 min；脫水：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇依次脫水2 min；伊紅染色液著色5 min；95%乙醇、100%乙醇 I、100%乙醇 II脫水2 min；二甲苯透明10 min，換新的二甲苯透明10 min。

1.4.4 封片、觀察 將透明結束的載玻片從二甲苯中取出，在切片中央滴一滴中性樹膠，然后用鑷子輕輕蓋上蓋玻片，避免產生氣泡，于LEICA DM 2000顯微鏡下觀察紅鰭東方鲀性腺內部結構。

2 結果

通過對44尾紅鰭東方鲀性腺外觀的觀察，發現其性腺形狀和顏色可分為兩種：一種為袋狀淡紅色，見圖1；另一種為長條狀乳白色，見圖2。它們對應的組織切片結果分別為圖3和圖4。圖3為紅鰭東方鲀處于第Ⅱ期的卵巢切片，此時初級卵母細胞處于小生長期，細胞質為嗜堿性，細胞核中核仁靠近核膜內側分布[6]。圖4為雄魚的精巢切片，圖中可明顯看到精母細胞和染成深色的精子[6]。本研究有22尾魚的性腺外觀表現為袋狀、淡紅色，為雌性個體；22尾魚的性腺外觀表現為長條狀、乳白色，為雄性個體。紅鰭東方鲀的雌、雄性別比例為1∶1。

圖1 袋狀淡紅色性腺

圖2 長條狀乳白色性腺

圖3 雌性性腺組織切片

圖4 雄性性腺組織切片

3 討論

早期的性別鑒定法主要是染色體核型分析法、組織切片法、H-Y抗原檢測法和X染色體酶活性檢測法等[7]。20世紀80年代后期，分子生物學方法開始應用于哺乳動物胚胎性別的鑒定，其具有很高的靈敏度和準確度[8]。隨著魚類性別決定相關基因如DMY、DMRT1、SOX、Tra2等[9-10]基因的發現，魚類分子生物學性別鑒定技術也相繼發展起來，有多聚酶鏈式反應（PCR）擴增雄性染色體特異基因、熒光原位雜交（FISH）和隨機擴增多態性DNA（RAPD）等[11-13]方法。

通過觀察發現，對于非繁殖季節的紅鰭東方鲀，其性腺外觀有兩種：一種為袋狀淡紅色，另一種為長條狀乳白色，推測具有袋狀淡紅色性腺的個體為雌性個體，具有長條狀乳白色性腺的個體為雄性個體。本研究采用組織切片技術進行分析鑒定此客觀差別和規律。利用組織切片法已對牙鲆、斑馬魚、暗紋東方鲀、石鰈、長江刀鱭、黃顙魚、大彈涂魚、半滑舌鰨等魚的性腺發育過程進行了研究。潘彬斌[14]用組織切片法觀察三角帆蚌性腺各時期發育；王晶等[15]利用組織切片法研究斑馬魚性腺發育過程，找到了斑馬魚的性別分化和性腺分化過程；王文君等[16]用組織切片法觀察了石鰈仔、幼魚性腺發育過程。這些研究都表明利用組織切片的方法可清晰辨別性腺類型，即通過組織切片得到的實驗結果是準確可靠的。本研究利用組織切片技術證明了體長20 cm左右的紅鰭東方鲀性腺為袋狀淡紅色的個體全部為雌性個體，性腺為長條狀乳白色的個體全部為雄性個體。對于需要采集體長為20 cm左右的紅鰭東方鲀不同的組織器官進行相關研究，又需要知道準確的性別來講，今后可通過解剖觀察其性腺的形狀和顏色，即可準確判定其雌或雄的性別，不必再用其他任何方法進行鑒定。通過解剖觀察性腺的形狀和顏色判定性別，該方法簡單、明了、準確。

參考文獻：

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[15]王晶，王冰，李紀同，等．斑馬魚性腺發育的組織學觀察[J]．基因組學與應用生物學，2011，30(2) ：168-174

[16]王文君，王開順，邵明瑜，等．石鰈仔、幼魚性腺發育的組織學觀察[J]．中國水產科學，2007，14(5) ：843-845

Sex identification by gonad shape and color in Takifugu rubripes

SUN Sai-hong，WANG Yu-fang，JIANG Zhi-qiang，QIU Xue-mei，WANG Xiu-li

（College of Fisheries and Life Sciences,Dalian Ocean University,Dalian 116023）

Abstract：44 Takifugu rubripes individuals of 18～20 cm body length and 200～250 g body weight were sampled randomly. The gonad of each individual was collected and its shape and color was recorded at the same time. Histological section technique was used to determinate the gender of Takifugu rubripes. The results showed that the individuals with bursiform pink gonads were females, the individuals with spindly lacte gonads were males. And the ratio in the sample between males and females was 1:1. The results could provide the evidence and reference for sex determination according to observe the gonad shapes and color in Takifugu rubripes which was nearly 20 cm in body length.

Key words：Takifugu rubripes；sex identification；gonad shape and color；histological section technique

（收稿日期：2013-12-04）

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Sex identification by gonad shape and color in Takifugu rubripes

SUN Sai-hong，WANG Yu-fang，JIANG Zhi-qiang，QIU Xue-mei，WANG Xiu-li

（College of Fisheries and Life Sciences,Dalian Ocean University,Dalian 116023）

Abstract：44 Takifugu rubripes individuals of 18～20 cm body length and 200～250 g body weight were sampled randomly. The gonad of each individual was collected and its shape and color was recorded at the same time. Histological section technique was used to determinate the gender of Takifugu rubripes. The results showed that the individuals with bursiform pink gonads were females, the individuals with spindly lacte gonads were males. And the ratio in the sample between males and females was 1:1. The results could provide the evidence and reference for sex determination according to observe the gonad shapes and color in Takifugu rubripes which was nearly 20 cm in body length.

Key words：Takifugu rubripes；sex identification；gonad shape and color；histological section technique

（收稿日期：2013-12-04）

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Sex identification by gonad shape and color in Takifugu rubripes

SUN Sai-hong，WANG Yu-fang，JIANG Zhi-qiang，QIU Xue-mei，WANG Xiu-li

（College of Fisheries and Life Sciences,Dalian Ocean University,Dalian 116023）

Abstract：44 Takifugu rubripes individuals of 18～20 cm body length and 200～250 g body weight were sampled randomly. The gonad of each individual was collected and its shape and color was recorded at the same time. Histological section technique was used to determinate the gender of Takifugu rubripes. The results showed that the individuals with bursiform pink gonads were females, the individuals with spindly lacte gonads were males. And the ratio in the sample between males and females was 1:1. The results could provide the evidence and reference for sex determination according to observe the gonad shapes and color in Takifugu rubripes which was nearly 20 cm in body length.

Key words：Takifugu rubripes；sex identification；gonad shape and color；histological section technique

（收稿日期：2013-12-04）