ELISA法檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留見(jiàn)解

梁娟+于盟盟+韓梅+魏海英+孟霞

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.04.019

硝基呋喃類(lèi)抗菌劑（Nitrofurans）是一種廣效性抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲(chóng)均有作用，因其價(jià)格低廉且對(duì)動(dòng)物性傳染病的預(yù)防與治療具有良好的效果而曾經(jīng)在養(yǎng)殖業(yè)中較為廣泛應(yīng)用。但是，經(jīng)研究證明，含有硝基呋喃類(lèi)抗菌劑及其代謝物的食物被人類(lèi)長(zhǎng)期食用后，有致癌、致畸胎等健康危害，因此已被大多數(shù)國(guó)家明令禁止在人類(lèi)可食用的動(dòng)物源性食品中使用。

硝基呋喃類(lèi)抗菌劑原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速，無(wú)法檢測(cè)；而其代謝物呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃咜酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazone）和呋喃妥因（Nitrofurantoin）能與組織蛋白質(zhì)緊密結(jié)合而相當(dāng)穩(wěn)定，故利用其代謝物的檢測(cè)可反映硝基呋喃類(lèi)抗菌劑的殘留狀況。

目前，動(dòng)物體內(nèi)硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、液相色譜—質(zhì)譜法和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法，上述方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，常作為藥物殘留檢測(cè)的確認(rèn)方法。然而此類(lèi)方法對(duì)儀器和操作人員要求都較高；每個(gè)樣品檢測(cè)費(fèi)用大；前處理過(guò)程均需過(guò)夜衍生，耗時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)抽檢的需求和推廣應(yīng)用。ELISA技術(shù)與上述儀器分析方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是樣本前處理過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)儀器和人員要求不是很高，檢測(cè)人員經(jīng)過(guò)短期培訓(xùn)即可上崗；二是樣品整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中所用試劑多數(shù)為無(wú)機(jī)試劑，與有機(jī)試劑相比，對(duì)人體傷害和環(huán)境污染威脅小，檢測(cè)人員無(wú)需特殊防護(hù)用具；三是該方法耗時(shí)短，檢測(cè)過(guò)程只需要不到1 h，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣本篩查；四是檢出限低，靈敏度高，可達(dá)到μg/kg或ng/kg水平，符合藥物殘留檢測(cè)分析的要求。

基于以上特點(diǎn)，ELISA法已成為目前藥品殘留檢測(cè)的有效檢測(cè)方法之一。

近幾年來(lái)，本中心利用ELISA法承擔(dān)上級(jí)漁業(yè)主管部門(mén)下達(dá)的水產(chǎn)品國(guó)家違禁藥物殘留的篩查任務(wù)，篩選出的陽(yáng)性樣品，分別經(jīng)山東省水產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃河水產(chǎn)研究所用大型儀器分析方法確證，準(zhǔn)確率為100%。在圓滿完成上級(jí)漁業(yè)主管部門(mén)下達(dá)的篩選任務(wù)的同時(shí)，本中心取得了一定的操作經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)將經(jīng)驗(yàn)小結(jié)，與大家共勉。

1 加標(biāo)回收

樣品在萃取、轉(zhuǎn)移及凈化處理等過(guò)程中，會(huì)有基體干擾或待檢成分的損失情況。因此，加標(biāo)回收率的測(cè)定是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)常用以自控的一種質(zhì)量控制技術(shù)，以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1.1 樣品空白的選取

樣品空白是指在檢測(cè)程序中，使用某個(gè)濃度的樣品作為儀器的零基準(zhǔn)。樣品空白可以抵消加入測(cè)試試劑前由于樣品自身含有待測(cè)成分引起的正誤差。空白樣品的選擇對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

加標(biāo)回收分空白加標(biāo)回收和樣品加標(biāo)回收兩種，幾年來(lái)，本中心針對(duì)這兩種加標(biāo)回收做了大量的驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品加標(biāo)回收，如果待測(cè)樣品背景值較高，所得回收率會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。本中心利用同一樣品對(duì)呋喃西林和呋喃咜酮兩個(gè)項(xiàng)目同時(shí)做加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果得知，該樣品中呋喃咜酮背景值很低，兩個(gè)添加濃度的加標(biāo)回收率均在80%～110%之間；而呋喃西林項(xiàng)目由于背景值較高，兩個(gè)添加濃度的回收率分別為207和81.7，出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

本中心還請(qǐng)教了省級(jí)水產(chǎn)品檢測(cè)中心等權(quán)威檢測(cè)機(jī)構(gòu)經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)家，得出的結(jié)論與本中心所做驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果一致。所以本中心一般選擇空白加標(biāo)回收，所得結(jié)果準(zhǔn)確率為100%。

表1 同一樣品不同項(xiàng)目的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)

項(xiàng)目 試樣測(cè)定值

/μg?kg-1 加標(biāo)濃度

/μg?kg-1 加標(biāo)試樣測(cè)定

值/μg?kg-1 加標(biāo)回

收率/%

呋喃咜酮 0.082 0.5 0.548 93.2

1.0 0.974 89.2

呋喃西林 0.242 0.5 1.281 207

1.0 1.059 81.7

1.2 加標(biāo)試驗(yàn)應(yīng)遵循的幾條原則

1.2.1 一致原則 樣品與加標(biāo)試樣按相同的操作步驟和方法同時(shí)測(cè)定，保證試驗(yàn)條件一致。為保證準(zhǔn)確度，樣品和加標(biāo)樣分別進(jìn)行平行測(cè)試，以平均值帶入計(jì)算。

1.2.2 可比原則 加標(biāo)樣中原始樣品的取樣量、稀釋倍數(shù)及測(cè)試體積，盡可能與測(cè)試樣品一致。

一般文獻(xiàn)上要求加標(biāo)量不宜過(guò)大，一般為待測(cè)成分含量的0.5～2.0倍，且加標(biāo)后的總含量不應(yīng)超過(guò)方法的測(cè)定上限。要想做到這一點(diǎn)，需要檢測(cè)人員正確估量樣品中待測(cè)成分的含量，這對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不是很豐富的檢測(cè)人員來(lái)說(shuō)難度有點(diǎn)大。本中心一般選取標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的中間濃度做加標(biāo)濃度。

1.2.3 不變?cè)瓌t 加標(biāo)物的濃度宜高，加標(biāo)體積宜小，一般不超過(guò)原始試樣體積的1%，保持樣品的基體不變。

1.2.4 適用原則 容易實(shí)施，便于回收率的計(jì)算。

加標(biāo)回收率=

（加標(biāo)式樣測(cè)定值-式樣測(cè)定值）加標(biāo)濃度×100%

2 加標(biāo)回收率的意義

加標(biāo)回收除了考察待測(cè)樣品前處理及上機(jī)測(cè)試全過(guò)程中所測(cè)成分的破壞或損失情況，更重要的一點(diǎn)，對(duì)于國(guó)家食品安全有殘留限量的藥物殘留，需要用加標(biāo)回收率折算檢測(cè)結(jié)果，以防止不合格樣品流向市場(chǎng)，給廣大消費(fèi)者造成傷害。例如，某種獸藥的限量值為1.0 μg/kg，如果某個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果為0.9 μg/kg，在不做加標(biāo)回收的情況下可以判定該產(chǎn)品合格。但是，如果做了加標(biāo)回收，加標(biāo)回收率為80%，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果和回收率折算，該產(chǎn)品的獸藥濃度為1.1 μg/kg，該產(chǎn)品應(yīng)被判定為不合格。

3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析利用

目前市面上ELISA試劑盒的價(jià)格普遍較高，一般96孔的試劑盒的價(jià)格在四五千元左右。進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，一般要求標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上才可以對(duì)樣品中待測(cè)成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量，但有時(shí)候難免出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)做的比較低的情況。為了節(jié)約試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，我們一般通過(guò)對(duì)相關(guān)系數(shù)比較低的曲線各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行分析。如果一條曲線相關(guān)系數(shù)的偏離只是因?yàn)闃O個(gè)別的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，其他的幾個(gè)點(diǎn)的線性關(guān)系良好，那么，只要是位于這幾個(gè)點(diǎn)濃度范圍內(nèi)的所檢樣品的檢測(cè)值是可信的。

4 ELISA方法操作過(guò)程中注意事項(xiàng)

4.1 樣品前處理

提取試劑的添加要準(zhǔn)確，渦旋混勻的時(shí)間要嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易造成乳化現(xiàn)象和溶解出更多的雜質(zhì)成分；時(shí)間過(guò)短，容易造成混合不均勻、提取不充分，造成假陰性。離心轉(zhuǎn)速或離心力應(yīng)達(dá)到說(shuō)明書(shū)要求，樣品氮吹時(shí)，應(yīng)盡量吹干，不要?dú)埩粲袡C(jī)溶劑。去除上層正己烷等脂肪層時(shí)，應(yīng)確保去除干凈，防止對(duì)結(jié)果造成干擾影響。

4.2 試劑盒保存

試劑盒應(yīng)當(dāng)在2～8 ℃的溫度下儲(chǔ)存（試劑盒說(shuō)明書(shū)有特殊規(guī)定的，嚴(yán)格按照規(guī)定的儲(chǔ)存條件執(zhí)行），不能在過(guò)熱或過(guò)冷的溫度下放置時(shí)間太長(zhǎng)。

微孔板應(yīng)盡量真空、干燥保存以保持更好的穩(wěn)定性，因此剩余的微孔板要盡快放回密封袋保存；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的顯色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

4.3 試劑盒平衡

每個(gè)試劑盒都有相應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度，用前一般需在室溫放置20～30 min以上。試劑及樣本沒(méi)有回復(fù)至室溫20～25 ℃，將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20 min。如果試劑體積較大則需要回溫時(shí)間較長(zhǎng)，不能用溫水浴回溫。

4.4 保證標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)力求與標(biāo)準(zhǔn)品同步檢測(cè)；

加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液以及各種試劑時(shí)，為確保時(shí)間的一致性，應(yīng)使用定量多道加液器，且加液過(guò)程要迅速完成；

定量多道加液器應(yīng)定期校準(zhǔn)，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)；

一個(gè)人操作時(shí)，一個(gè)項(xiàng)目一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。

4.5 避免板內(nèi)差異性大應(yīng)注意的問(wèn)題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時(shí)推到二檔，出液時(shí)推到一檔；

加液后若出現(xiàn)氣泡會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過(guò)程中若有液體濺出，不但對(duì)鄰近孔造成污染，而且會(huì)流到板底，影響吸光度，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；

加樣應(yīng)盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準(zhǔn)確性。

4.6 試劑盒操作的環(huán)境條件

確保在標(biāo)準(zhǔn)室溫20～25 ℃下操作，避免在空調(diào)風(fēng)口或者窗口進(jìn)行操作，溫度過(guò)低，會(huì)出現(xiàn)吸光度值偏低的現(xiàn)象；如果在陽(yáng)光直射下試驗(yàn)，不但會(huì)因?yàn)檫^(guò)熱造成試劑蒸發(fā)，而且會(huì)造成吸光度值偏高等導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果失準(zhǔn)的現(xiàn)象。如果操作臺(tái)溫度過(guò)低，應(yīng)鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗的關(guān)鍵因素之一；

孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，以免出現(xiàn)吸光度值偏高或偏低的現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；

孵育過(guò)程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達(dá)到孵育要求；

如果樣品量少，一次測(cè)定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，以提高測(cè)定的重復(fù)性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數(shù)以及每次每孔洗液的加入量要規(guī)范，以免因洗滌不當(dāng)而造成吸光度值過(guò)高的現(xiàn)象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準(zhǔn)確性；

最后一次洗滌后進(jìn)行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果；

板孔干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)低、重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測(cè)定中，若出現(xiàn)0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時(shí)，即使標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到要求亦不能采用。為了避免出現(xiàn)這種情況，在定量測(cè)定中，顯色時(shí)間一般根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)控制。也可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在顯色較深時(shí)，適當(dāng)提前2～3 min終止反應(yīng)；在顯色較淺時(shí)，適當(dāng)延長(zhǎng)2～3 min顯色反應(yīng)時(shí)間。

4.11 假陽(yáng)性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

見(jiàn)表2。

表2 假陽(yáng)性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

問(wèn)題 原因 解決方法

假陽(yáng)性

假陰性 水質(zhì)原因

試驗(yàn)操作

原因

實(shí)驗(yàn)儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點(diǎn)復(fù)溶液驗(yàn)證 應(yīng)確保純水

現(xiàn)制現(xiàn)用

離心不徹底 延長(zhǎng)離心時(shí)間或

改變轉(zhuǎn)速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準(zhǔn)確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機(jī)試劑干擾 更換試劑

有機(jī)試劑變質(zhì) 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步驟之中，本文特對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題及原因歸納總結(jié)，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）

4.4 保證標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)力求與標(biāo)準(zhǔn)品同步檢測(cè)；

加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液以及各種試劑時(shí)，為確保時(shí)間的一致性，應(yīng)使用定量多道加液器，且加液過(guò)程要迅速完成；

定量多道加液器應(yīng)定期校準(zhǔn)，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)；

一個(gè)人操作時(shí)，一個(gè)項(xiàng)目一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。

4.5 避免板內(nèi)差異性大應(yīng)注意的問(wèn)題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時(shí)推到二檔，出液時(shí)推到一檔；

加液后若出現(xiàn)氣泡會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過(guò)程中若有液體濺出，不但對(duì)鄰近孔造成污染，而且會(huì)流到板底，影響吸光度，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；

加樣應(yīng)盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準(zhǔn)確性。

4.6 試劑盒操作的環(huán)境條件

確保在標(biāo)準(zhǔn)室溫20～25 ℃下操作，避免在空調(diào)風(fēng)口或者窗口進(jìn)行操作，溫度過(guò)低，會(huì)出現(xiàn)吸光度值偏低的現(xiàn)象；如果在陽(yáng)光直射下試驗(yàn)，不但會(huì)因?yàn)檫^(guò)熱造成試劑蒸發(fā)，而且會(huì)造成吸光度值偏高等導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果失準(zhǔn)的現(xiàn)象。如果操作臺(tái)溫度過(guò)低，應(yīng)鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗的關(guān)鍵因素之一；

孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，以免出現(xiàn)吸光度值偏高或偏低的現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；

孵育過(guò)程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達(dá)到孵育要求；

如果樣品量少，一次測(cè)定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，以提高測(cè)定的重復(fù)性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數(shù)以及每次每孔洗液的加入量要規(guī)范，以免因洗滌不當(dāng)而造成吸光度值過(guò)高的現(xiàn)象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準(zhǔn)確性；

最后一次洗滌后進(jìn)行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果；

板孔干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)低、重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測(cè)定中，若出現(xiàn)0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時(shí)，即使標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到要求亦不能采用。為了避免出現(xiàn)這種情況，在定量測(cè)定中，顯色時(shí)間一般根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)控制。也可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在顯色較深時(shí)，適當(dāng)提前2～3 min終止反應(yīng)；在顯色較淺時(shí)，適當(dāng)延長(zhǎng)2～3 min顯色反應(yīng)時(shí)間。

4.11 假陽(yáng)性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

見(jiàn)表2。

表2 假陽(yáng)性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

問(wèn)題 原因 解決方法

假陽(yáng)性

假陰性 水質(zhì)原因

試驗(yàn)操作

原因

實(shí)驗(yàn)儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點(diǎn)復(fù)溶液驗(yàn)證 應(yīng)確保純水

現(xiàn)制現(xiàn)用

離心不徹底 延長(zhǎng)離心時(shí)間或

改變轉(zhuǎn)速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準(zhǔn)確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機(jī)試劑干擾 更換試劑

有機(jī)試劑變質(zhì) 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步驟之中，本文特對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題及原因歸納總結(jié)，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）

4.4 保證標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)力求與標(biāo)準(zhǔn)品同步檢測(cè)；

加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液以及各種試劑時(shí)，為確保時(shí)間的一致性，應(yīng)使用定量多道加液器，且加液過(guò)程要迅速完成；

定量多道加液器應(yīng)定期校準(zhǔn)，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)；

一個(gè)人操作時(shí)，一個(gè)項(xiàng)目一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。

4.5 避免板內(nèi)差異性大應(yīng)注意的問(wèn)題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時(shí)推到二檔，出液時(shí)推到一檔；

加液后若出現(xiàn)氣泡會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過(guò)程中若有液體濺出，不但對(duì)鄰近孔造成污染，而且會(huì)流到板底，影響吸光度，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；

加樣應(yīng)盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準(zhǔn)確性。

4.6 試劑盒操作的環(huán)境條件

確保在標(biāo)準(zhǔn)室溫20～25 ℃下操作，避免在空調(diào)風(fēng)口或者窗口進(jìn)行操作，溫度過(guò)低，會(huì)出現(xiàn)吸光度值偏低的現(xiàn)象；如果在陽(yáng)光直射下試驗(yàn)，不但會(huì)因?yàn)檫^(guò)熱造成試劑蒸發(fā)，而且會(huì)造成吸光度值偏高等導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果失準(zhǔn)的現(xiàn)象。如果操作臺(tái)溫度過(guò)低，應(yīng)鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗的關(guān)鍵因素之一；

孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，以免出現(xiàn)吸光度值偏高或偏低的現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；

孵育過(guò)程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達(dá)到孵育要求；

如果樣品量少，一次測(cè)定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，以提高測(cè)定的重復(fù)性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數(shù)以及每次每孔洗液的加入量要規(guī)范，以免因洗滌不當(dāng)而造成吸光度值過(guò)高的現(xiàn)象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準(zhǔn)確性；

最后一次洗滌后進(jìn)行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果；

板孔干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)低、重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測(cè)定中，若出現(xiàn)0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時(shí)，即使標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到要求亦不能采用。為了避免出現(xiàn)這種情況，在定量測(cè)定中，顯色時(shí)間一般根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)控制。也可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在顯色較深時(shí)，適當(dāng)提前2～3 min終止反應(yīng)；在顯色較淺時(shí)，適當(dāng)延長(zhǎng)2～3 min顯色反應(yīng)時(shí)間。

4.11 假陽(yáng)性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

見(jiàn)表2。

表2 假陽(yáng)性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

問(wèn)題 原因 解決方法

假陽(yáng)性

假陰性 水質(zhì)原因

試驗(yàn)操作

原因

實(shí)驗(yàn)儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點(diǎn)復(fù)溶液驗(yàn)證 應(yīng)確保純水

現(xiàn)制現(xiàn)用

離心不徹底 延長(zhǎng)離心時(shí)間或

改變轉(zhuǎn)速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準(zhǔn)確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機(jī)試劑干擾 更換試劑

有機(jī)試劑變質(zhì) 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步驟之中，本文特對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題及原因歸納總結(jié)，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）