茄子青枯病誘導的cDNA文庫構建與鑒定

蔣晶等

摘要：以茄子抗青枯病自交系E-31為材料，在4葉期接種青枯病菌，48 h后采集葉片提取RNA，利用Gateway技術構建茄子uncut型cDNA文庫。經檢測，本研究獲得的茄子葉片cDNA文庫滴度達到0.01億CFU/mL，總庫容量為0.15億CFU，平均插入片段長度在1.2 kb以上，重組率為100%。說明構建的文庫能達到所需要的標準，可用于分離茄子的功能基因。

關鍵詞：uncut型cDNA文庫；Gateway技術；茄子；青枯病

中圖分類號： S641.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0022-03

收稿日期：2013-08-31

基金項目：國家自然科學基金（編號：30972005）；廣東省自然科學基金（編號：9151064201000063）；廣東省自然科學基金研究團隊項目（編號：S2011030001410）；廣東省教育廳華南園藝作物種質資源利用與改良重點實驗室項目（編號：KBL11008）。

作者簡介：蔣晶（1990—），女，湖南寧鄉人，碩士研究生，主要從事茄子抗青枯病基因功能鑒定。E-mail：92157135@qq.com。

通信作者：曹必好，教授。Tel：（020）85280228；E-mail：caobh01@163.com。茄子（Solanum melongena L.）是一種在亞洲、地中海、中歐及東南歐地區廣泛栽培的蔬菜作物[1]。在高溫高濕的季節，茄子易受青枯病害的侵襲，發病嚴重時可造成產量和品質的大幅下降，已成為影響茄子高產的主要因素[2]。目前，有關茄子抗青枯病的分子育種進展緩慢，茄子對青枯病的抗性分子機制仍然不清楚，若要解析這些機理，必須分離出相關抗性基因以及互作基因，并對它們進行功能鑒定，這對開展持久、廣譜的茄子抗病分子育種具有重要的意義[3]。構建一個完整的cDNA文庫是開展分子生物學研究的基礎，也是克隆新基因和研究基因功能的有效策略之一[4-6]。未剪切cDNA文庫構建的基本原理是采用Invitrogen專利的Gateway位點特異性重組技術，將mRNA轉變成兩頭帶有attB重組位點的雙鏈cDNA，通過定點重組，cDNA被定向克隆到Gateway的供體載體，從而產生初級文庫，該初級文庫可以通過和各種Gateway目的載體進行Gateway LR重組，構建成為不同的表達文庫[7-9]。未剪切cDNA文庫的全長比例和庫容量等均優于標準cDNA 文庫。目前有關茄子cDNA 文庫的構建報道不多，本研究應用 Gateway 技術構建高質量的茄子未剪切型 cDNA 文庫，旨在為未來分離有用的功能基因打下基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料本試驗材料為茄子高抗自交系E-31，由華南農業大學曹必好教授提供。

1.1.2試劑pDONR222，CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Ki，TRIzol Reagent，FastTrack MAG mRNA isolation Kit，SuperScript Ⅲ，Platinum Taq DNA Polymerase均購自 Invitrogen 公司。

1.2方法

1.2.1青枯病接種青枯病菌為生理小種1，從田間發病植株中分離得到。青枯病菌在斜面培養基上培養，培養基為肉汁胨培養基（基本培養基成分：牛肉浸膏3 g、蛋白胨5～10 g、蔗糖 10 g、瓊脂17～20 g、蒸餾水1 000 mL、 pH值7.0），在恒溫 30 ℃ 下增殖培養24 h。分離時在基本培養基上加入005%氯化三苯四氮唑（TZC），挑起白色流動性強菌落，在未加瓊脂的上述培養基上進行培養。將增殖培養的病原菌菌液加無菌水稀釋。用紫外分光光度計在波長650 nm處測定病菌濃度，將菌液濃度調制成1億CFU/mL懸濁液。在幼苗為4葉期時，采用傷根-蘸根法人工接種，菌液濃度為1億CFU/mL浸根，時間為20 min。把幼苗定植于營養缽中，放入恒溫培養箱中30 ℃培養48 h，采集葉片提取RNA。

1.2.2總RNA的提取及mRNA的分離取1 g組織樣品，采利用Trizol提取樣品的總RNA。取500 μg提取的總RNA，冰上融化放置，加DEPC水置總體積500 μL，參照FastTrack MAG mRNA isolation Kit說明書進行mRNA的分離純化。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA及mRNA的純度和質量。

1.2.3cDNA的合成（1）cDNA第一鏈的合成參照CloneMiner說明書進行。將2 μg mRNA溶于10 μL DEPC水中，加入 biotin-attB2-Oligo（dT） Primer （30 pmol） 1 μL混勻，65 ℃ 5 min，降溫到45 ℃孵育2 min，加入5 × First Strand Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，45 ℃ 孵育2 min；最后加入200 U/μL SuperScript Ⅱ RT 2 μL 混勻，置于PCR儀上反應45 ℃ 20 min、50 ℃ 20 min、55 ℃ 20 min。（2）cDNA第二鏈的合成。在上述溶液中加入DEPC水 91 μL，5×Second Strand Buffer 30 μL，dNTPs （10 mmol/L）3 μL，大腸肝菌DNA Ligase（10 U/μL） 1 μL，大腸桿菌DNA PolymeraseⅠ（10 U/μL） 4 μL 大腸桿菌RNaseH（2 U/μL）1 μL混勻，16 ℃條件下反應2 h；最后加入T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃，反應 5 min。將獲得的雙鏈cDNA純化，溶解于DEPC水中。

1.2.4cDNA與attB1重組接頭連接將下列組分加入到 6 μL 雙鏈cDNA中，使得cDNA雙鏈加入attB1接頭：5×Adapter Buffer 10 μL，attB1 Adapter （1 μg/μL） 10 μL，0.1 mol/L DTT 7 μL，T4 DNA Ligase（1 U/μL）5 μL，DEPC水12 μL混勻后 16 ℃ 保溫20 h。

1.2.5BP重組反應及文庫的構建取cDNA 13 μL于 20 μL 反應體系[pDONR222 （250 ng/μL）2 μL，BP Clonase Ⅱ enzyme mix 5 μL]混勻后置于25 ℃下反應20 h，進行BP重組。利用電轉化法將重組質粒轉入大腸桿菌DH10B中。將轉化的大腸桿菌置于37 ℃、225～250 r/min搖床上培養 1 h，加入甘油至終濃度20%存于-80 ℃，即得文庫菌液。

1.2.6cDNA文庫質量鑒定

1.2.6.1庫容量的鑒定取轉化后細菌原液10 μL稀釋 1 000 倍后，從中取出50 μL涂布LB平板（卡那霉素，工作濃度是50 μg/mL）上，第2天計數。文庫菌液的單位菌落數（CFU/mL）=平板上的克隆數/50 μL×1 000倍×1 000 μL，文庫總菌落數（CFU）=文庫菌液的單位菌落數（CFU/mL）×文庫菌液總體積（mL）。

1.2.6.2重組率和插入片段長度鑒定隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，在Microtube中配制總體積為20 μL的反應液[ddH2O 16.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，M13F（20 μmol/L）0.5 μL，M13R（20 μmol/L）0.5 μL，DNA Polymerase（5 U/μL）0.3 μL]，放置在Thermal Cycler PCR儀上進行PCR反應，擴增程序為：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃保溫5 min。擴增結束后，擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。M13F：TGTAAAACGACGGCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC。

2結果與分析

2.1RNA及mRNA質量

提取的總 RNA 在瓊脂糖凝膠上進行電泳，從電泳結果中可看到 28S、18S、5S等3條清晰的電泳條帶（圖1），28S與18S的亮度比接近2 ∶1，D260 nm/D280 nm及D260 nm/D230 nm的值在1.9～2.0之間，表明該樣品總RNA基本上沒有降解，完整性良好，無蛋白質和多糖的污染，可以作為起始樣品用于文庫構建。mRNA電泳結果為一片模糊的拖帶（圖1），這是由于mRNA的長度不一所造成的，且拖帶最亮部分的范圍在較大的分子量范圍內（大于500 bp），由此可以認定mRNA未出現降解，完整性較好。

2.2文庫質量鑒定

2.2.1總克隆數CFU的鑒定LB平板37 ℃ 過夜培養，在平板上長出75個單一克隆（圖2）。根據公式得到其單位菌落數（平板稀釋度1 ∶1 000）=75/50 μL×1 000×1 000=0015億CFU/mL，文庫總庫容量=0.015億CFU/mL×10 mL=0.15億CFU。

2.2.2插入片段大小及重組率鑒定隨機挑取的24個克隆PCR產物經凝膠電泳檢測，平均插入片段長度在1.2 kb以上，重組率為100%（圖3）。

按照CloneMiner cDNA Library Construction Kit的要求，一個高質量文庫的滴度應大于0.01億CFU/mL，文庫總容量大于500萬CFU，陽性克隆率大于95%，平均插入片段大于或等于1.5 kb。由此可見，本研究構建的茄子葉片cDNA文庫是一個質量較高的文庫。

3結論與討論

植物組織中的RNA含量較低，且離體植物組織的 RNA 降解速度很快。RNA提取是分子生物學的基本技術之一，其困難首先是RNA非常容易降解而RNase又無處不在，并且非常穩定；其次是組織中的次生物質如酚類、多糖等也會影響RNA的質量[10-11]。

在本試驗中cDNA的分級分離是一個不可忽視的環節。用凝膠柱除去已消化的接頭碎片和小片段的cDNA分子，收集片段大小合適的cDNA樣品。這樣保證了文庫中cDNA具有較大的分子，對篩選有重要意義，可明顯減少后期篩選的工作量。

未剪切cDNA文庫構建的基本原理是采用Invitrogen專利的Gateway位點特異性重組技術，其優點在于無需使用限制性內切酶和連接酶，基本克服了常規cDNA文庫構建方法中存在的被限制性內切酶切開而無法得到完整的基因序列，以及連接效率不高的缺陷[12]。一個高質量cDNA文庫的關鍵就是要保證文庫的完整性與覆蓋度[13]。本試驗所構建的茄子cDNA文庫，插入片段絕大多數在1.2 kb以上，文庫總容量達到0.15億CFU，重組率達到100%，而一般的普通的cDNA文庫滴度只需要0.01億CFU/mL，重組率達到80%以上，插入片段的大小達到500 bp以上的標準，由此可見，本研究所構建的cDNA是高質量的cDNA文庫。

cDNA便于克隆和大量表達，它不像基因組含有內含子而難以表達，因此，可以從cDNA文庫中篩選到所需要的目的基因，并且可直接用于該目的基因的表達[14]。cDNA文庫構建目前己廣泛應用于不同發育階段基因表達的變化、某特定發育期基因表達的分子機制、克隆新型細胞因子、分離新的組織特異基因等方面的研究[15-21]。隨著cDNA文庫構建技術的日益提高和普及，cDNA文庫已成為克隆相關基因的一種首選方法，在基因操作過程中具有十分廣泛的基礎性作用，近年來，構建cDNA文庫已在植物抗病蟲、抗逆境分子機理等研究領域廣泛應用[22-26]。

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