牦牛和黃牛Prdm9基因鋅指域序列的比較

馬曉琴等

摘要：為了研究牦牛雜交雄性不育的分子機制，采用3′-RACE方法分別從牦牛、黃牛睪丸組織的總RNA中獲取其Prdm9基因的部分cDNA序列，長度分別為1 548、1 392 bp，包含全部的鋅指域。對比分析顯示：牦牛、黃牛的Prdm9基因均含有5個連續的C2H2型鋅指，每個鋅指均由21個氨基酸構成，鋅指間是高度保守序列TGEKPYV，并且鋅指域從這段高度保守序列開始；牦牛、黃牛各自Prdm9基因中的5個鋅指間在氨基酸構成上存在差異，并且二者在整個鋅指域上有6個氨基酸差異，其中5個都在鋅指中的重要正向選擇位點處，推測這些氨基酸差異可能與牦牛種間雜交后代的雄性不育有關。

關鍵詞：牦牛；黃牛；雜交雄性不育；睪丸；Prdm9基因

中圖分類號： S823.8+52；S823.8+12 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0028-02

收稿日期：2013-12-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：31240053）；中央高校基本科研業務費資助課題（編號：12NZYTH06），西南民族大學研究生創新型科研項目（編號：CX2013SZ55）。

作者簡介：馬曉琴（1987—），女，甘肅武威人，碩士，主要從事動物生物化學與分子遺傳學研究。E-mail：maxiaoqin1987@hotmail.com。

通信作者：鄭玉才（1965—），男，內蒙古海拉爾人，博士，教授，主要從事牦牛的研究。E-mail：yucaizheng65@hotmail.com。牦牛（Bos grunniens）主要分布在我國海拔3 km以上的青藏高原，是該地區主要的家畜。牦牛與普通牛（Bos taurus）的種間雜交后代稱犏牛，犏牛雖然具有明顯的雜種優勢，但卻表現為雄性不育，犏牛雄性不育的缺陷制約了其雜種優勢的利用，但是其機理尚不清楚。在雜交雄性不育的機制研究方面，20世紀70年代就發現了雜交不育-1（hybrid sterility-1，hst1）基因，2009年證實該基因就是Prdm9（PR domain containing 9）。Prdm9是催化組蛋白H3的4位賴氨酸發生三甲基化修飾的甲基轉移酶，該基因不但是人類、小鼠減數分裂期重要轉錄調控因子和重組熱點定位的主控因子，而且是迄今為止報道的唯一與哺乳動物雜種不育相關的基因[1-3]。PRDM9蛋白能夠通過其高度重復的鋅指域結合特定DNA序列，從而使結合該蛋白較多的區域成為同源重組熱點區域[4]。Prdm9基因可限制家鼠亞種之間的雜交，敲出、插入或缺失1個鋅指都可導致小鼠的雜交不育[2]。Prdm9基因只在雌、雄性小鼠進入減數分裂前期的生殖細胞內表達[3]，其發現為研究雜交不育提供了新的思路。本研究對牦牛、黃牛Prdm9基因的鋅指域cDNA序列進行克隆和序列比對分析，以期為揭示牦牛種間雜交后代雄性不育的機制提供參考資料。

1材料與方法

1.1樣品的采集

于2012年11月在四川省青白江象牙牛市選擇健康的成年麥洼公牦牛（4～6歲，n=3）和公黃牛（4～6歲，n=3）。屠宰后30 min內迅速取出其睪丸組織并浸入RNAlater溶液中，冰浴條件下帶回實驗室，用于提取RNA。

1.2試劑與儀器

主要試劑包括：TRIzol、RNAlater，購自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 試劑盒，購自TaKaRa公司。引物的合成與測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

主要儀器包括：PowerPac 3000電泳儀，Bio-Rad公司；Versa Doc1000凝膠成像系統；WPA Biowave核酸蛋白檢測儀；Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR儀。

1.3睪丸組織總RNA的提取

參照TRIzol試劑（Invitrogen公司）的產品說明書，從牦牛、黃牛的睪丸組織中提取總RNA，用WPA Biowave核酸蛋白檢測儀測定提取的RNA濃度和純度。

1.4牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列的克隆測序與分析

采用3′-RACE方法擴增牦牛、黃牛Prdm9基因的鋅指序列。先使用3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 試劑盒反轉錄3′-RACE的cDNA第一條鏈，然后再進行3′-RACE PCR擴增，技術流程和操作方法參照說明書。根據牦牛的Prdm9 mRNA的部分序列（GenBank登錄號：JX454531），用Primer Premier 5.0軟件設計特異上游引物（Prdm9-F1：TGCTCTCTGGCCTTCTCCAGTCAGAAGTTC），匹配試劑盒自帶的下游引物，分別擴增牦牛、黃牛的Prdm9基因鋅指序列。PCR程序為：95 ℃ 3.5 min；95 ℃ 30 s，68 ℃ 3.5 min，38個循環；72 ℃ 8 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用膠回收試劑盒純化回收特異條帶。將回收的DNA片段與載體pMD19-T連接，再轉化到宿主大腸桿菌DH5α中進行克隆，最后分別挑選4個牦牛、黃牛的陽性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。測序的結果采用Primer Premier 50軟件翻譯成氨基酸，再用DNAMAN軟件進行比對分析。

2結果與分析

2.1牦牛、黃牛Prdm9基因部分序列的擴增

經檢測，提取的RNA純度和濃度達到了RACE擴增要求。由圖1可見，用3′-RACE法分別從牦牛、黃牛睪丸組織中獲得了約1 500、1 400 bp的特異擴增條帶。測序結果表明，這2個條帶為Prdm9基因的部分片段，長度分別為1 548、1 392 bp。

2.2牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列分析

由圖2可知，對比分析牦牛、黃牛的Prdm9鋅指域序列發現，它們是含有5個連續的C2H2型鋅指，每個鋅指有21個氨基酸。還可以看出，與普通牛預測的鋅指結構一樣，牦牛、黃牛的鋅指間是保守序列“TGEKPYV”，并且鋅指域從這個保守序列開始。由表1還可以看出，牦牛、黃牛不僅在各自的5個鋅指間的氨基酸種類上存在差異，而且在整個鋅指域的4個鋅指中有6處氨基酸不同，這些差異的氨基酸在性質上有很大不同。

3結論與討論

本試驗通過對牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指域的克隆與分析，發現了一些重要的氨基酸差異，為進一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基礎，期望能夠為深入研究牦牛雜交雄性不育的分子機制提供參考資料。

參考文獻：

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2.2牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列分析

由圖2可知，對比分析牦牛、黃牛的Prdm9鋅指域序列發現，它們是含有5個連續的C2H2型鋅指，每個鋅指有21個氨基酸。還可以看出，與普通牛預測的鋅指結構一樣，牦牛、黃牛的鋅指間是保守序列“TGEKPYV”，并且鋅指域從這個保守序列開始。由表1還可以看出，牦牛、黃牛不僅在各自的5個鋅指間的氨基酸種類上存在差異，而且在整個鋅指域的4個鋅指中有6處氨基酸不同，這些差異的氨基酸在性質上有很大不同。

3結論與討論

本試驗通過對牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指域的克隆與分析，發現了一些重要的氨基酸差異，為進一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基礎，期望能夠為深入研究牦牛雜交雄性不育的分子機制提供參考資料。

參考文獻：

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2.2牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列分析

由圖2可知，對比分析牦牛、黃牛的Prdm9鋅指域序列發現，它們是含有5個連續的C2H2型鋅指，每個鋅指有21個氨基酸。還可以看出，與普通牛預測的鋅指結構一樣，牦牛、黃牛的鋅指間是保守序列“TGEKPYV”，并且鋅指域從這個保守序列開始。由表1還可以看出，牦牛、黃牛不僅在各自的5個鋅指間的氨基酸種類上存在差異，而且在整個鋅指域的4個鋅指中有6處氨基酸不同，這些差異的氨基酸在性質上有很大不同。

3結論與討論

本試驗通過對牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指域的克隆與分析，發現了一些重要的氨基酸差異，為進一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基礎，期望能夠為深入研究牦牛雜交雄性不育的分子機制提供參考資料。

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[8]Parvanov E D，Petkov P M，Paigen K. Prdm9 controls activation of mammalian recombination hotspots[J]. Science，2010，327（5967）：835.

[9]Thomas J H，Emerson R O，Shendure J. Extraordinary molecular evolution in the PRDM9 fertility gene[J]. PLoS One，2009，4（12）：e8505.

[10]Laity J H，Chung J，Dyson H J，et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor protein modulates DNA binding activity through isoform-specific DNA-induced conformational changes[J]. Biochemistry，2000，39（18）：5341-5348.

[11]Oliver P L，Goodstadt L，Bayes J J，et al. Accelerated evolution of the Prdm9 speciation gene across diverse metazoan taxa[J]. PLoS Genetics，2009，5（12）：e1000753.

[12]Irie S，Tsujimura A，Miyagawa Y，et al. Single-nucleotide polymorphisms of the PRDM9（MEISETZ） gene in patients with nonobstructive azoospermia[J]. Journal of Andrology，2009，30（4）：426-431.