基于PCR—DGGE的中江丹參輪作期間土壤細菌遺傳多樣性變化特征

林貴兵等

摘要：為了解四川中江丹參輪作期間土壤細菌遺傳多樣性變化特征，分離提取土壤微生物DNA，以細菌通用引物PCR擴增，DGGE分離，切割條帶、回收并測序，在GenBank中查得菌種。結(jié)果表明，中江丹參輪作期間，土壤細菌主要群落包括：Alpha proteobacterium，Sphingomonas sp.，Uncultured bacterium isolate LH2-12，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band h，Uncultured Arthrobacter sp.，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band a1-11，Uncultured Sphingomonas sp.。休種1年與當年種植丹參土壤細菌多樣性相似，而與休種3年土壤細菌種群結(jié)構(gòu)有明顯差異；休種第2年屬于過渡。說明中江丹參輪作期休種為其土壤細菌群落遺傳多樣性逐漸恢復(fù)平衡過程；且休地第2年是關(guān)鍵時期，與筆者前期采用培養(yǎng)法及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：丹參土壤細菌；PCR-DGGE；遺傳多樣性；變化特征

中圖分類號：S567.5+30.1；S154.3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）04-0048-04

收稿日期：2013-08-20

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81173493）；國家科技支撐計劃（編號：2006BAI09B03-4）。

作者簡介：林貴兵（1981—），男，四川自貢人，博士，講師，研究方向為中藥資源可持續(xù)利用與藥材質(zhì)量標準化。Tel：（0791）87118997；E-mail：linguibing897@gmail.com。

通信作者：嚴鑄云，博士。E-mail：cdtcmyan@126.com。丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。在中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）實施過程中，中藥材種植快速發(fā)展；但也出現(xiàn)了一些嚴重的問題，如連作障礙。丹參忌連作，連作導(dǎo)致病蟲害嚴重，其質(zhì)量和產(chǎn)量明顯下降[1]。土壤生物環(huán)境惡化是引起作物連作障礙形成的主要機制之一[2]。研究結(jié)果表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與土傳病害、連作障礙有著密切的關(guān)系[3]；對地黃[4]、麥冬[5]和蒼術(shù)[6]研究認為，土壤微生物群落失衡是引起連作障礙的主要因素之一。在前期的研究中，通過純培養(yǎng)法試驗發(fā)現(xiàn)，種植丹參的土壤中各類微生物數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，重新建立土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡；栽培丹參后土壤微生物群落自然恢復(fù)間隔至少為2年[7]。前期的研究方法主要是通過培養(yǎng)法研究土壤微生物群落，但此法只能對土壤中的可培養(yǎng)優(yōu)勢微生物進行分析，而土壤中有絕大部分是不可培養(yǎng)微生物，因此培養(yǎng)法不能全面反映其微生物群落。本試驗以PCR-DGGE技術(shù)研究中江丹參栽培輪作休地期間其土壤細菌群落遺傳多樣性變化特征，以揭示細菌群落結(jié)構(gòu)在土壤微生物群落平衡自然恢復(fù)的變化特征，為丹參栽培地輪作期間土壤退化的修復(fù)以及緩解連作障礙提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試土壤基本情況

試驗區(qū)設(shè)在四川中江石泉鎮(zhèn)范圍內(nèi)，104°35′26″E，30°57′04″N，屬中亞熱帶濕潤氣候區(qū)；年平均氣溫16.5 ℃，年均降雨量1 200～1 400 mm；地形為臺地，地勢較平坦，面積 1 km2，土壤屬紅黃壤，海拔750 m。

2008年3月在試驗區(qū)范圍內(nèi)，選取丹參休種（現(xiàn)為油菜）1～4年的樣地，長寬在20 m×10 m以上；每一休種年選5塊樣地，丹參休種期間，為油菜-小麥的輪作體系；采用雙“S”法采樣與四分法取1.0 kg土壤，用牛皮紙袋裝好，帶回實驗室，在4 ℃下保存?zhèn)溆茫?月內(nèi)進行土壤微生物分析。

1.2土壤微生物的解離

取土壤樣品2.0 g，加入20 g/L的偏磷酸鈉（pH值8.5，含10 g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30），渦旋振蕩，離心，去上清液。

1.3土壤微生物DNA提取方法

參照文獻[8-11]，略作改良，具體如下：（1）取沉淀于SDS裂解液中渦旋；（2）68 ℃溫浴1 h，同時輕輕搖動，12 000 r/min 離心，取上清液體；（3）加入0.125倍體積的 5 mol/L 的醋酸鉀和0.42倍的40%的 PEG-8000；在-20 ℃下沉淀約15 min，12 000 r/min離心15 min，去上清液；（4）加入CTAB 提取液中溶解沉淀，68 ℃溫浴15 min，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕柔混均勻，12 000 r/min離心10 min；（5）在DNA上清液中加入0.6～1.0倍體積的異丙醇，-20 ℃放置3 h以上，13 000 r/min離心20 min；（6）用70%乙醇洗DNA 2～3次，自然晾干，加無菌水溶解備用。

1.4DNA檢測

1.5PCR過程

3討論

本試驗采用PCR-DGGE技術(shù)研究土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化特征，結(jié)果表明，四川中江丹參種植和休種期間，其土壤細菌群落遺傳多樣性發(fā)生了變化，導(dǎo)致土壤微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且在不同的丹參休種年限之間差異明顯，特別是在栽培丹參后休種第2年屬于過渡階段，是土壤細菌群落失衡恢復(fù)的重要時期。這對采用改良土壤微生態(tài)環(huán)境以緩解丹參連作障礙有重要的實用指導(dǎo)價值，有利于揭示丹參連作障礙形成關(guān)鍵因素。

PCR-DGGE法研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有快速、可重復(fù)性等優(yōu)點，在近幾年來研究土壤微生物生態(tài)等領(lǐng)域研究上得到廣泛應(yīng)用，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法培養(yǎng)微生物種群局限性的缺點，能對土壤中不可培養(yǎng)的微生物菌群進行研究[16]。但是，本技術(shù)依賴于對土壤微生物DNA提取技術(shù)和PCR技術(shù)，因此DNA提取的土壤微生物菌群的全面性和PCR擴增的引物、擴增條件優(yōu)化等因素對DGGE分離菌群豐富度具有至關(guān)重要的影響。

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