抗煙草花葉病毒活性放線菌的初步篩選和鑒定

曹毅等

摘要：為篩選對煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）具有拮抗活性的放線菌，以烤煙Coker 176、K326為材料，采用生物活性測試和半葉枯斑法，測定47株放線菌菌株發酵上清液抗TMV的活性，對具活性的菌株進行分子鑒定和系統發育分析。結果表明，6株放線菌的發酵上清液具有一定的抗TMV活性，其中菌株F187、F349、F417發酵上清液對TMV具有明顯鈍化作用，發酵上清液與TMV作用30 min后抑制率分別為57.18%、60.27%、70.19%；分子鑒定和系統發育分析顯示菌株F187、F417、F349均屬鏈霉菌；鏈霉菌F187、F349、F417的代謝產物對TMV有較高的抑制活性，值得在菌種鑒定、發酵條件優化、活性物質的分離與鑒定等方面進行深入研究。

關鍵詞：煙草普通花葉病毒（TMV）；放線菌；抗病毒活性；分子鑒定

中圖分類號： Q435.72 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0100-03

收稿日期：2013-11-12

基金項目：貴州省科學技術基金（編號：黔科合J字[2012]2257號、黔科合J字[2011]2336號）。

作者簡介：曹毅（1982—），男，云南會澤人，碩士，助理研究員，從事微生物和植物保護研究。E-mail：yicao1001@163.com。煙草普通花葉病毒病（tobacco mosaic virus，TMV）嚴重威脅煙草的品質和產量，給煙草生產和煙草種植者造成了嚴重的經濟損失。由于植物病毒對寄主細胞的絕對寄生性、植物缺乏完整的免疫系統以及病毒傳播方式的多樣性，目前尚無有效的防治措施和藥劑。由煙草病毒病造成的經濟損失已超過真菌引起的病害，成為煙草生產上威脅最大的一類病害[1]。長期以來，人們使用有機或無機化合物進行植株病毒病防治，不僅防效甚微[2]，也容易帶來農藥污染。安全可靠、環境友好的生物源農藥成為病毒防治藥劑的研究熱點。與植物源、動物源農藥相比，微生物源農藥具有資源豐富、成本低、效果穩定和易商品化等特點[3-4]，是公認的無公害農藥。近年來國內外大量研究表明，許多細菌[5]、真菌[6]和大型真菌[7]的代謝產物具有良好的抗植物病毒活性，為防治植物病毒病開辟了新的途徑。

放線菌是一類極具經濟價值和廣泛應用前景的微生物資源，因其豐富的代謝產物，已被廣泛應用于工業、農業和醫學領域。放線菌來源的抗病毒活性物質如寧南霉素（ningnanmycin）、嘧肽霉素（cytosinpeptidemycin）、全霉素（holomycin）等對植物病毒病具有一定的治療效果[5]。由于病毒侵染危害植物的作用機理復雜以及植物病毒學研究方法受到一些因素制約等原因，其研究開發還處于初級階段，目前我國登記生產的微生物源抗植物病毒劑還很少。因此，不斷挖掘有生物活性的放線菌資源，開發有自主知識產權、對環境友好且高效的抗病毒劑，具有重要的社會、生態和經濟意義[8]。

本研究對前期從云南、貴州、河南等全國主要植煙區健康煙草根際土壤分離純化的放線菌進行發酵產物抗病毒活性篩選，通過16S rDNA序列和系統發育分析對具有抗病毒活性的菌株進行分類地位的確定，以期為抗病毒放線菌資源的篩選和綠色農業的發展提供基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1放線菌菌株供試的47株放線菌均采集、分離自田間健康煙草根際土壤。

1.1.2烤煙品種TMV枯斑寄主煙草Coker 176、系統侵染寄主煙草K326，由貴州省煙草科學研究院良種繁育中心提供。

1.1.3供試毒源供試病毒為純化的TMV，試驗前繁殖保存于煙草K326。

1.1.4培養基高氏1號培養基：可溶性淀粉20 g、KH2PO4 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、KNO3 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌 20 min 后備用。

黃豆粉培養基：黃豆粉 25 g、酵母浸膏 5 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨2 g、可溶性淀粉 10 g、CaCO3 0.5 g，蒸餾水定容至1 L，調節pH值至7.2，121 ℃ 滅菌 30 min。

1.1.5主要試劑16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit、DL2000 DNA Marker、Premix Ex Taq購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa），其他試劑均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1放線菌發酵產物的制備供試菌株接種于高氏1號培養基，28 ℃培養箱中活化培養4 d，用直徑5 mm的打孔器打取菌株生長良好的菌餅，接種于裝有100 mL高氏1號液體培養基的250 mL三角瓶中，每瓶6塊；28 ℃、180 r/min振蕩培養4 d后按5%的接種量接種于發酵培養基中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養7 d后，無菌條件下吸取發酵產物于滅菌離心管中8 000 r/min離心15 min，收集菌株發酵上清液，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2寄主培養和病毒接種供試煙草按常規育苗規程進行培育管理，7～8張葉時用于病毒接種。取新鮮感染TMV的病葉置于滅菌研缽中加適量金剛砂研磨勻漿，加入0.01 mol/L pH值7.2的磷酸緩沖液，離心后取上清液，配制40倍液的病毒汁液（40 mL/g病葉）。接種前噴灑適量金剛砂于葉片表面，用配置的病毒汁液進行常規摩擦接種，接種2 min后用清水噴霧沖洗葉面，于25 ℃無蟲溫室內進行。

1.2.3抗TMV活性菌株的篩選初篩：取長勢一致的K326每2株分為1組，病毒汁液摩擦接種后，分別在接種后的第2、4、6 天噴灑20%的待測放線菌發酵上清液，設置陰性空白對照（病毒接種后噴灑20%的未接菌發酵培養液）、陽性發病對照（病毒接種后噴灑滅菌蒸餾水）。第10天開始觀察記錄發病情況，每組2株的心葉脈明、輕微花葉，或上部不超過 1/3 葉片花葉以及2株中只有1株出現1/3～1/2葉片花葉或少許變形或主側脈壞死，植株矮化為正常株高的2/3以上的記錄菌株號，保留備用。2株都出現1/2～2/3葉片花葉或變形或主側脈壞死或全株葉片花葉或嚴重變形或壞死，病株明顯矮化的則放棄。

復篩：將初篩保留的菌株發酵液與等量TMV病葉汁液混合，室溫放置30 min后，以發酵培養基與病毒汁液混合為陽性對照，采用半葉枯斑法[9]接種4～5葉期的TMV枯斑寄主烤煙Coker 176，左半葉接種對照，右半葉接種經發酵液處理的TMV病葉汁液。每個處理4～5張葉，重復3次。接種5～7 d后記錄枯斑數，計算病毒抑制率：

抑制率=（對照枯斑數-處理枯斑數）/對照枯斑數×100%。

1.2.4活性菌株的分子鑒定對具有抗TMV活性的菌株進行分子生物學鑒定，菌株基因組DNA的小量提取參照Li等的方法[10]進行。PCR引物為細菌16S rRNA序列通用引物（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），參照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒說明書進行。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交北京諾賽基因組中心有限公司進行測序。

1.2.5菌株系統發育分析通過NCBI網站上的BLAST程序將測定的序列與GenBank中的序列比較，從GenBank中獲取和試驗菌株相近種的16S rDNA序列，利用MEGA 5.1軟件構建進化樹[11]。

2結果與分析

2.1抗TMV放線菌的篩選

將前期分離保存的47株放線菌活化后進行搖瓶發酵，收集47份發酵正常、無雜菌污染發酵上清液分別進行初篩試驗，結果表明：大部分放線菌發酵上清液無抗TMV作用，噴灑后的植株第10天逐漸表現葉脈間褪綠、葉片畸變、嚴重系統花葉至葉片壞死或矮化、或死亡，而其中6株放線菌發酵上清液處理植株未出現發病癥狀或僅表現較輕微的斑駁或系統花葉，具有一定的抗病毒TMV作用。將初篩的6株放線菌發酵上清液在Coker 176上進行半葉枯斑法復篩驗證，枯斑抑制率的結果見表1。從表1可以看出，菌株F187、F349、F417發酵上清液對TMV具有明顯鈍化作用，發酵上清液與TMV作用30 min后，抑制率分別為57.18%、60.27%、70.19%，菌株F370、F350-2、F251的抑制作用相對較差。

3結論與討論

由TMV導致的煙草花葉病毒是煙草生產中的一類主要病害[12]，其在病葉殘體和土壤中可以存活數年，有很強的抗逆性。據調查，貴州移栽期煙苗的TMV平均帶毒率可達202%[13]，可見其對貴州省煙草生產具有較大的潛在危害。從微生物資源中篩選抗植物病毒病物質已成為病毒病防治研究的熱點，利用放線菌的抗病毒活性物制備新農藥是未來無

公害農藥的主要發展方向[13]。目前人們已發現鏈霉菌中多個種如諾爾斯鏈霉菌西昌變種（Strepcomces noursei var. xichangensis）、不吸水鏈霉菌遼寧變種（Streptomyces ahygroscopicus var. Liaoningensis）等放線菌產生的抗生素及非抗生素類物質對植物病毒病具有一定的治療效果[14-15]。本研究中的放線菌均采集、分離自煙草根際土壤，煙草根際特有的環境可能使得菌株具有獨特的代謝方式而產生具有特殊活性的代謝產物。本研究篩選的3株放線菌發酵上清液表現了明顯的體外抗TMV活性，具有進一步研究和開發的價值。

本研究的主要目的在于篩選具有抗TMV活性的放線菌，筆者只對菌株發酵上清液的抗TMV活性進行了初步研究，其菌體是否具有活性還未研究；研究中采用了適合大多數放線菌的發酵培養基及發酵條件進行發酵，而培養基種類及成分、放線菌菌齡、接種量、搖培時間及轉速等對發酵液活性都有一定影響，今后可對活性放線菌的發酵條件進行優化，對活性物質的種類開展深入研究，同時結合基因工程菌的手段和方法，進一步挖掘、探索其在抗植物病毒上的開發應用潛力。

致謝：云南農業大學李應萍同學參加了病毒接種和枯斑數統計工作，在此一并致謝。

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