野生黃蟬蘭多倍體誘導初報

王玉英等

摘要：以野生黃蟬蘭無菌苗的叢生芽為供試材料，分別用濃度為0.008%、0.010%、0.030%、0.060%、0.120%、0150%、0.200%的秋水仙素對其處理24、48、72 h。結果表明，以0.06%秋水仙素處理72 h的誘導效果最佳，誘導變異率達62.5%，死亡率為22.5%；多倍體黃蟬蘭材料在形態上出現葉色深綠、植株粗壯和葉片增厚等優良性狀，同時氣孔和染色體數目都有明顯變化，可作為新材料加以利用。

關鍵詞：野生黃蟬蘭；秋水仙素；多倍體誘導

中圖分類號： S682.310.36 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0132-03

收稿日期：2013-11-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：30160074）；科技部成果轉化項目（編號：2012GB2F300423）；云南省自然科學基金重點項目（編號：2002C0003P）；云南省重點新產品開發項目（編號：2012BB008）。

作者簡介：王玉英（1980—），女，云南大理人，博士，講師，主要從事植物資源的利用和創新研究。E-mail：wyysxp@126.com。

通信作者：李枝林，教授，主要從事觀賞植物資源利用及創新研究。 E-mail：lzl-yn@sohu.com。黃蟬蘭（Cymbidium iridioides D. Don）為蘭科蘭屬大花亞屬的植物。根據陳心啟等的分類，大花亞屬包括黃蟬蘭、虎頭蘭、碧玉蘭、長葉蘭、沉香虎頭蘭、文山紅柱蘭等[1]。黃蟬蘭屬附生，假鱗莖橢圓狀卵形至狹卵形，長4～11 cm、寬2～5 cm，總狀花序，具3～17朵花；花苞片近三角形，長2～3 mm；花梗和子房長4.0～4.5 cm；花較大，直徑達10 cm，有香氣；花期8—12月，果期11月。它產于我國西南山區高海拔處，如云南貢山、福貢、盈江、騰沖、龍陵、德欽、臨滄、云縣、景東、勐海、建水、元陽、綠春、屏邊、麻栗坡、硯山等地，附生于海拔750～2 500 m的常綠闊葉林中的樹上或巖石上，分布于我國西藏東南部（察隅）、四川西南部以及尼泊爾、不丹、錫金、印度東北部、緬甸北部。它與虎頭蘭的最大區別是花期不同，虎頭蘭一般在1月左右開花，黃蟬蘭花形較虎頭蘭嚴整，花色、花朵與虎頭蘭相似[2]。該類蘭以其花色基調不同又可分為黃蟬蘭、青蟬蘭、紅蟬蘭和朱砂蟬蘭，較適合作育種親本或切花材料，具有較高的應用價值和開發價值。

蘭花生長周期長，繁殖系數低，在育種過程造成了相當程度的阻力。近年來，利用多倍體育種已培育出許多蘭花新品種。通常多倍體植物具有植株粗壯、花朵碩大、花色艷麗、葉質增寬增厚、適應性增強及次生代謝物積累量高等特點。秋水仙素誘變的多倍體有四倍體、六倍體、八倍體等[3]。目前，已有春蘭[4]、沉香虎頭蘭[5]、墨蘭× 大花蕙蘭的F1代[6]、素心黃[7]、寒蘭[8]、雜交蘭根狀莖[3]、大花蕙蘭紅寶石原球莖[9]和野生碧玉蘭[10]等蘭屬植物多倍體誘導的報道，而野生黃蟬蘭的倍性育種尚未見報道。本研究建立在組織培養的基礎上，通過秋水仙素誘導形成多倍體植株，以期為黃蟬蘭多倍體育種提供科學依據和技術基礎。

1材料與方法

1.1材料

野生黃蟬蘭收集于云南省文山州馬關縣，并在云南農業大學花卉研究所蘭花資源圃中馴化栽培2年以上；選用前期研究培養出的種子無菌萌發試管苗，以后代遺傳性狀穩定的叢芽作為供試材料。試驗于2010年在云南農業大學花卉研究所實驗室內進行。

1.2方法

1.2.1多倍體的誘導配制濃度為0.008%、0.010%、0030%、0.060%、0.120%、0.150%、0.200%的秋水仙素溶液，高壓滅菌。取健康、長勢相對一致的新生叢生芽，在無菌條件下浸泡在經滅菌的秋水仙素溶液中，分別處理24、48、72 h。處理后用無菌水沖洗3～4次，在無菌的濾紙上吸干水分，轉入最佳復壯培養基（1/2MS+2.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+8%香蕉泥，pH值5.8）上，于（25±1） ℃下光照培養，處理40 d觀察苗體的死亡情況，處理90 d觀察苗體的變異情況，每隔50 d轉接1次，進行相關統計。

1.2.2多倍體的鑒定

1.2.2.1形態學觀察根據多倍體植株與二倍體植株在葉形、葉色、株形、株色、生長勢上呈現出的差異，對變異植株進行初選。對黃蟬蘭葉的長與寬進行測量，各檢測20株。

1.2.2.2氣孔鑒定氣孔大小與植株倍性呈正相關，氣孔密度與植株倍性呈負相關，以該特性作為多倍體初步鑒定的方法之一。取二倍體植株和變異植株葉片，平均分成上、中、下3個部分，撕取葉片下表皮，在顯微鏡下觀察。采用目鏡測微尺測定氣孔的長徑、短徑，用橢圓面積近似公式（S=長徑×短徑）計算氣孔的面積，各檢測30個。

1.2.2.3染色體鑒定蘭科植物具有粗大的根系，根被厚厚的海綿狀的白色根被所覆蓋，中央有1個維管組織的髓部。根據該特點采用以下制片方案。

取材時間和取材部位：根據經驗，09：50—10：15取材染色體中期分裂較旺盛。取材部位為健壯植株剛剛長出根的幼嫩根尖組織。（1）預處理液的比較。將取出的長度為0.5 cm的根尖放入口徑為5 cm的小瓶中，分別加入0.002 mol/L 8-羥基喹啉和0.1%秋水仙素2種預處理液，于常溫下預處理7 h左右，洗滌后轉入Caronys液（乙醇與乙酸體積比3 ∶1）中，置于冰水中固定半小時，取出瓶后放入60 ℃ 1 mol/L HCl中水解6 min。水解時間過長，細胞質不著色，染色體染色較淺，只有在水解時間適宜時才可獲得染色體呈深紅色或紫紅色，細胞質無色或只有極淺淡的紅色[11]。（2）染色。用蒸餾水清洗3～5次解離過的材料（如果清洗不干凈，則染色效果較差，影響拍攝效果），按材料的多少，加入一定量的卡寶品紅液，直到淹沒瓶中的根尖，約半小時后便可壓片。（3）壓片。采用常規壓片法，取處理過的根尖于載玻片上，滴1滴卡寶品紅液，蓋上蓋玻片，用解剖針輕敲大團根尖，使其分散，再用疊好的濾紙按住蓋玻片的對角，用橡皮頭輕敲團狀物，使細胞均勻分散，將濾紙放在蓋玻片上，用拇指緊按住濾紙一端，另一拇指垂直地按住蓋玻片，以使細胞平整。（4）鏡檢。將做好的切片放于B203/B203LED型雙目生物顯微鏡下觀察染色體分散情況，記錄并攝像。endprint

2結果與分析

2.1不同秋水仙素濃度和處理時間誘變黃蟬蘭的效果

3結論與討論

秋水仙素對細胞有毒害作用，經其處理的材料前期生長緩慢，這種毒害作用隨著處理濃度的增加或時間的延長而加劇，從而使細胞死亡率增加。因此，要掌握合適的處理濃度和時間才能獲得最好的加倍效果。李涵等對沉香虎頭蘭新幼芽進行多倍體誘導，發現0.05%秋水仙素處理72 h效果最好，變異率為74%，死亡率為20%[5]。李雪嬌等對碧玉蘭叢生芽進行多倍體誘導，發現0.04%秋水仙素處理72 h效果最好，誘導變異率達60%，死亡率為30%[10]。尹翠翠等對雜交蘭F1代的根狀莖進行誘導，發現0.10%秋水仙素處理48h誘導效果最佳，變異率為36%，死亡率為8%[3]。本研究結果表明，用0.060%秋水仙素處理72 h對黃蟬蘭的誘導效果最佳，變異率高達62.5%，死亡率僅為22.5%，說明秋水仙素能有效誘導黃蟬蘭多倍體。

在植物組織器官發育過程中，具有分裂功能的體細胞受到秋水仙素等化學處理或光、熱等物理處理或自然環境的變化，都可促使部分細胞突變，這種變異細胞和未突變的正常細胞可以形成一個共同的植物生長點原基，進而形成特有的植物嵌合體現象[12]。Norris等在試驗中發現，嵌合體中不同層次的細胞在培養過程中可以共同發育成一個生長原基，從而實現母體型嵌合體的復制，但在大多數情況下，通過組織培養進行不斷分離純化獲得的嵌合體株率是很低的[13]。不同誘導材料對秋水仙素的敏感程度有較大差異[11]。鄭思鄉等用秋水仙素處理苧麻的叢生芽，獲得94%四倍體[14]。本研究將變異材料的叢芽進行不斷的分離純化，從而獲得較高概率的四倍體植株，且在后代中表現穩定。

參考文獻：

[1]陳心啟，吉占和. 中國蘭花全書[M]. 北京：中國林業出版社，1997：80.

[2]陳心啟. 中國植物志：第十八卷[M]. 北京：科學出版社，1999：202.

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[9]楊麗娟，高素萍，鄒宗蘭. 秋水仙素離體誘導大花蕙蘭多倍體試驗[J]. 中國種業，2008（12）：60-61.

[10]李雪嬌，李枝林，黃麗萍. 野生碧玉蘭多倍體誘導及鑒定[J]. 中國農學通報，2010，26（13）：261-266.

[11]譚德冠，莊南生，黃華孫. 組織培養與秋水仙堿誘導相結合培育植物多倍體的應用[J]. 亞熱帶植物科學，2005，34（1）：77-80.

[12]李明銀，何云曉. 植物遺傳嵌合體及其在觀賞植物育種中的應用[J]. 植物學通報，2005，22（6）：641-647.

[13]Norris R E，Smith R H，Vaughn K C. Plant chimeras used to establish the de novo origin of shoots[J]. Science，1983，220（4592）：75-76.

[14]鄭思鄉，羅慧敏，董延瑜，等. 組織培養在苧麻多倍體研究中的應用初報[J]. 湖南農業大學學報，1995，21（4）：361-365.endprint

2結果與分析

2.1不同秋水仙素濃度和處理時間誘變黃蟬蘭的效果

3結論與討論

秋水仙素對細胞有毒害作用，經其處理的材料前期生長緩慢，這種毒害作用隨著處理濃度的增加或時間的延長而加劇，從而使細胞死亡率增加。因此，要掌握合適的處理濃度和時間才能獲得最好的加倍效果。李涵等對沉香虎頭蘭新幼芽進行多倍體誘導，發現0.05%秋水仙素處理72 h效果最好，變異率為74%，死亡率為20%[5]。李雪嬌等對碧玉蘭叢生芽進行多倍體誘導，發現0.04%秋水仙素處理72 h效果最好，誘導變異率達60%，死亡率為30%[10]。尹翠翠等對雜交蘭F1代的根狀莖進行誘導，發現0.10%秋水仙素處理48h誘導效果最佳，變異率為36%，死亡率為8%[3]。本研究結果表明，用0.060%秋水仙素處理72 h對黃蟬蘭的誘導效果最佳，變異率高達62.5%，死亡率僅為22.5%，說明秋水仙素能有效誘導黃蟬蘭多倍體。

在植物組織器官發育過程中，具有分裂功能的體細胞受到秋水仙素等化學處理或光、熱等物理處理或自然環境的變化，都可促使部分細胞突變，這種變異細胞和未突變的正常細胞可以形成一個共同的植物生長點原基，進而形成特有的植物嵌合體現象[12]。Norris等在試驗中發現，嵌合體中不同層次的細胞在培養過程中可以共同發育成一個生長原基，從而實現母體型嵌合體的復制，但在大多數情況下，通過組織培養進行不斷分離純化獲得的嵌合體株率是很低的[13]。不同誘導材料對秋水仙素的敏感程度有較大差異[11]。鄭思鄉等用秋水仙素處理苧麻的叢生芽，獲得94%四倍體[14]。本研究將變異材料的叢芽進行不斷的分離純化，從而獲得較高概率的四倍體植株，且在后代中表現穩定。

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[14]鄭思鄉，羅慧敏，董延瑜，等. 組織培養在苧麻多倍體研究中的應用初報[J]. 湖南農業大學學報，1995，21（4）：361-365.endprint

2結果與分析

2.1不同秋水仙素濃度和處理時間誘變黃蟬蘭的效果

3結論與討論

秋水仙素對細胞有毒害作用，經其處理的材料前期生長緩慢，這種毒害作用隨著處理濃度的增加或時間的延長而加劇，從而使細胞死亡率增加。因此，要掌握合適的處理濃度和時間才能獲得最好的加倍效果。李涵等對沉香虎頭蘭新幼芽進行多倍體誘導，發現0.05%秋水仙素處理72 h效果最好，變異率為74%，死亡率為20%[5]。李雪嬌等對碧玉蘭叢生芽進行多倍體誘導，發現0.04%秋水仙素處理72 h效果最好，誘導變異率達60%，死亡率為30%[10]。尹翠翠等對雜交蘭F1代的根狀莖進行誘導，發現0.10%秋水仙素處理48h誘導效果最佳，變異率為36%，死亡率為8%[3]。本研究結果表明，用0.060%秋水仙素處理72 h對黃蟬蘭的誘導效果最佳，變異率高達62.5%，死亡率僅為22.5%，說明秋水仙素能有效誘導黃蟬蘭多倍體。

在植物組織器官發育過程中，具有分裂功能的體細胞受到秋水仙素等化學處理或光、熱等物理處理或自然環境的變化，都可促使部分細胞突變，這種變異細胞和未突變的正常細胞可以形成一個共同的植物生長點原基，進而形成特有的植物嵌合體現象[12]。Norris等在試驗中發現，嵌合體中不同層次的細胞在培養過程中可以共同發育成一個生長原基，從而實現母體型嵌合體的復制，但在大多數情況下，通過組織培養進行不斷分離純化獲得的嵌合體株率是很低的[13]。不同誘導材料對秋水仙素的敏感程度有較大差異[11]。鄭思鄉等用秋水仙素處理苧麻的叢生芽，獲得94%四倍體[14]。本研究將變異材料的叢芽進行不斷的分離純化，從而獲得較高概率的四倍體植株，且在后代中表現穩定。

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[14]鄭思鄉，羅慧敏，董延瑜，等. 組織培養在苧麻多倍體研究中的應用初報[J]. 湖南農業大學學報，1995，21（4）：361-365.endprint