超聲破碎酵母細胞提取蔗糖酶條件優化

李聰　朱曉吉

摘要：采用單因素試驗和L9（33）正交試驗確定釀酒酵母的最佳超聲破碎條件。結果表明，釀酒酵母的最佳超聲破碎條件為：破碎功率350 W、總工作時間25 min、工作時間/間歇時間15 s/25 s。

關鍵詞：酵母細胞；蔗糖酶；酶活性；超聲破碎法；正交試驗

中圖分類號： TS201.2+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0237-03

收稿日期：2013-08-26

作者簡介：李聰（1984—），女，遼寧撫順人，碩士研究生，助理實驗師，研究方向為食品微生物發酵。E-mail：lcfayewong@126.com。蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）別稱轉化酶，能催化蔗糖水解產生葡萄糖、果糖，是一種廣泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。目前蔗糖酶已在農產品加工業[2]、食品工業[3-4]、醫藥行業[5-6]中發揮重要作用。工業上一般從酵母中提取蔗糖酶[7]。蔗糖酶屬于胞內水解酶，提取時須對酵母細胞進行破壁處理，酵母細胞的破壁方法主要有機械研磨法、酶解法、反復凍融法等[8]，這些方法都有一些不足之處，例如酶解法耗時長、費用高，機械研磨法操作復雜、損耗大等[9]。超聲波具有空化效應，會產生機械剪切壓力而使細胞破碎[10-11]。本研究采用超聲波法破碎酵母細胞，以期找出有效保存酵母蔗糖酶活性的超聲破碎條件。

1材料與方法

1.1菌株

釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）GY 7，由遼寧石油化工大學化學化工與環境學部實驗室保存。

1.2培養基

種子培養基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 15 g/L，氯化鈉4 g/L，pH值 7.0。

搖瓶發酵培養基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 1 g/L，pH 值5.5。

1.3儀器設備

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；全溫振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技生物有限公司）。

1.4方法

1.4.1釀酒酵母的培養及收集向裝有30 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶中接種兩環斜面種子，30 ℃、150 r/min 振蕩培養24 h，得到二級種子液。將二級種子液以10%的接種量接入100 mL發酵培養基中，29 ℃、搖床轉速160 r/min條件下培養27 h左右。取菌液于4 000 r/min離心10 min，得到酵母菌體細胞。

1.4.2超聲破碎釀酒酵母將離心得到的菌體用pH值4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液沖洗2次，取菌體1 g，加入到50 mL緩沖液中充分振蕩混勻制成菌懸液，在超聲細胞破碎儀中破碎，破碎條件按單因素試驗和正交試驗表進行。

1.4.3酵母蔗糖酶的提取 將超聲破碎后細胞懸濁液于 12 000 r/min 離心20 min，得到上清即為粗酶液。向粗酶液中加入乙醇使其質量分數達30%，4 ℃放置過夜，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，再追加投入乙醇使其終質量分數達50%。4 ℃放置1 h，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用雙蒸水溶解，4 ℃保存[12]。

3結論與討論

釀酒酵母細胞壁較厚，在超聲破碎過程中超聲功率的選擇非常重要，功率較小影響酵母細胞破碎率，導致酵母蔗糖酶活力較低；而功率過大則會引起細胞懸液飛濺或產生泡沫。

超聲破碎的工作時間/間歇時間對蔗糖酶活力有顯著影響，當超聲破碎時間大于間歇時間時，超聲破碎過程中產生了較多熱量，而較短的間歇時間使熱量無法散發，從一定程度上破壞了蔗糖酶活性。因此設定工作時間/間歇時間時，應使超聲時間短于間歇時間。

本研究以酵母蔗糖酶活力為指標，將超聲破碎功率、總工作時間、工作時間/間歇時間列為考察因素，通過單因素試驗及正交試驗探尋超聲破碎酵母細胞的最佳條件。試驗優化后的超聲破碎條件為超聲功率350 W，總工作時間25 min，工作時間/間歇時間15 s/25 s。優化后的超聲破碎酵母細胞法與酸堿裂解法、反復凍融法、酶解法相比，更為簡便、快捷、經濟、實用，適于實驗室及小規模的破碎酵母提取蔗糖酶等胞內活性物質試驗。

參考文獻：

[1]郭小路，張萬秋，闕瑞琦，等. 薄荷幼葉蔗糖酶的分離純化與部分性質[J]. 西南大學學報：自然科學版，2008，30（2）：90-94.

[2]梁東麗，谷潔，高華，等. 不同禽畜糞便靜態高溫堆肥過程中蔗糖酶活性的變化[J]. 農業環境科學學報，2009，28（7）：1535-1540.

[3]崔虎山，黃曉靜，王山，等. 低溫生產高活性右旋糖苷蔗糖酶的明串珠菌的篩選[J]. 食品科技，2011，36（12）：6-9.

[4]陳冰，林軒，梁詩瑩，等. 蔗糖酶水解蔗糖的研究[J]. 湛江師范學院學報：自然科學版，1997，18（2）：57-60.

[5]陳維順，于皆平，沈志祥，羅和生.蔗糖酶作為大腸腺瘤惡變傾向標志的研究[J]. 中國腫瘤臨床，1996，23（8）：542-544.

[6]吳衍昌，范業鵬，孫秀玲，等. 口腔腫瘤惡變與唾液蔗糖酶活性的相關性研究[J]. 黑龍江醫學，2000，7（7）：3-5.

[7]余瑞元，倪逸聲，王林，等. 大鼠、小鼠胰蛋白酶的分離純化及動力學性質[J]. 生物化學雜志，1993，9（6）：659-663.

[8]楊翠竹，李艷，阮南，等. 酵母細胞破壁技術研究與應用進展[J]. 食品科技，2006，31（7）：138-142.

[9]李宏君，尹際彤，楊啟東. 細胞破碎方法簡述[J]. 黑龍江醫藥，2002，15（2）：124.

[10]嚴娟，蔡志翔，張斌斌，等. 桃果肉總酚提取和測定方法的研究[J]. 江蘇農業學報，2013，29（3）：642-647.

[11]蔣彥婕，吳紀中，張巧鳳，等. 紫小麥麩皮花色苷提取工藝及其結構[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1146-1151.

[12]鄭學玲，李利民，姚惠源.小麥麩皮水溶性戊聚糖的分離及分級純化[J]. 無錫輕工大學學報：食品與生物技術，2004，23（2）：1-4.

[13]Miller G L. Use of DinitrosaIicylic acid reagent invertase for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959（31）：426-428.

[14]徐樺，陸珊華，孫愛民. 酵母蔗糖酶Km值的測定[J]. 南京醫科大學學報：自然科學版，1999，19（4）：329-331.

[15]戴佳錕，李燕，馬齊，等. 從畢赤酵母中提取外源重組蛋白的超聲破碎條件及優化[J]. 食品科學，2012，33（10）：57-60.endprint

摘要：采用單因素試驗和L9（33）正交試驗確定釀酒酵母的最佳超聲破碎條件。結果表明，釀酒酵母的最佳超聲破碎條件為：破碎功率350 W、總工作時間25 min、工作時間/間歇時間15 s/25 s。

關鍵詞：酵母細胞；蔗糖酶；酶活性；超聲破碎法；正交試驗

中圖分類號： TS201.2+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0237-03

收稿日期：2013-08-26

作者簡介：李聰（1984—），女，遼寧撫順人，碩士研究生，助理實驗師，研究方向為食品微生物發酵。E-mail：lcfayewong@126.com。蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）別稱轉化酶，能催化蔗糖水解產生葡萄糖、果糖，是一種廣泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。目前蔗糖酶已在農產品加工業[2]、食品工業[3-4]、醫藥行業[5-6]中發揮重要作用。工業上一般從酵母中提取蔗糖酶[7]。蔗糖酶屬于胞內水解酶，提取時須對酵母細胞進行破壁處理，酵母細胞的破壁方法主要有機械研磨法、酶解法、反復凍融法等[8]，這些方法都有一些不足之處，例如酶解法耗時長、費用高，機械研磨法操作復雜、損耗大等[9]。超聲波具有空化效應，會產生機械剪切壓力而使細胞破碎[10-11]。本研究采用超聲波法破碎酵母細胞，以期找出有效保存酵母蔗糖酶活性的超聲破碎條件。

1材料與方法

1.1菌株

釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）GY 7，由遼寧石油化工大學化學化工與環境學部實驗室保存。

1.2培養基

種子培養基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 15 g/L，氯化鈉4 g/L，pH值 7.0。

搖瓶發酵培養基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 1 g/L，pH 值5.5。

1.3儀器設備

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；全溫振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技生物有限公司）。

1.4方法

1.4.1釀酒酵母的培養及收集向裝有30 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶中接種兩環斜面種子，30 ℃、150 r/min 振蕩培養24 h，得到二級種子液。將二級種子液以10%的接種量接入100 mL發酵培養基中，29 ℃、搖床轉速160 r/min條件下培養27 h左右。取菌液于4 000 r/min離心10 min，得到酵母菌體細胞。

1.4.2超聲破碎釀酒酵母將離心得到的菌體用pH值4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液沖洗2次，取菌體1 g，加入到50 mL緩沖液中充分振蕩混勻制成菌懸液，在超聲細胞破碎儀中破碎，破碎條件按單因素試驗和正交試驗表進行。

1.4.3酵母蔗糖酶的提取 將超聲破碎后細胞懸濁液于 12 000 r/min 離心20 min，得到上清即為粗酶液。向粗酶液中加入乙醇使其質量分數達30%，4 ℃放置過夜，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，再追加投入乙醇使其終質量分數達50%。4 ℃放置1 h，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用雙蒸水溶解，4 ℃保存[12]。

3結論與討論

釀酒酵母細胞壁較厚，在超聲破碎過程中超聲功率的選擇非常重要，功率較小影響酵母細胞破碎率，導致酵母蔗糖酶活力較低；而功率過大則會引起細胞懸液飛濺或產生泡沫。

超聲破碎的工作時間/間歇時間對蔗糖酶活力有顯著影響，當超聲破碎時間大于間歇時間時，超聲破碎過程中產生了較多熱量，而較短的間歇時間使熱量無法散發，從一定程度上破壞了蔗糖酶活性。因此設定工作時間/間歇時間時，應使超聲時間短于間歇時間。

本研究以酵母蔗糖酶活力為指標，將超聲破碎功率、總工作時間、工作時間/間歇時間列為考察因素，通過單因素試驗及正交試驗探尋超聲破碎酵母細胞的最佳條件。試驗優化后的超聲破碎條件為超聲功率350 W，總工作時間25 min，工作時間/間歇時間15 s/25 s。優化后的超聲破碎酵母細胞法與酸堿裂解法、反復凍融法、酶解法相比，更為簡便、快捷、經濟、實用，適于實驗室及小規模的破碎酵母提取蔗糖酶等胞內活性物質試驗。

參考文獻：

[1]郭小路，張萬秋，闕瑞琦，等. 薄荷幼葉蔗糖酶的分離純化與部分性質[J]. 西南大學學報：自然科學版，2008，30（2）：90-94.

[2]梁東麗，谷潔，高華，等. 不同禽畜糞便靜態高溫堆肥過程中蔗糖酶活性的變化[J]. 農業環境科學學報，2009，28（7）：1535-1540.

[3]崔虎山，黃曉靜，王山，等. 低溫生產高活性右旋糖苷蔗糖酶的明串珠菌的篩選[J]. 食品科技，2011，36（12）：6-9.

[4]陳冰，林軒，梁詩瑩，等. 蔗糖酶水解蔗糖的研究[J]. 湛江師范學院學報：自然科學版，1997，18（2）：57-60.

[5]陳維順，于皆平，沈志祥，羅和生.蔗糖酶作為大腸腺瘤惡變傾向標志的研究[J]. 中國腫瘤臨床，1996，23（8）：542-544.

[6]吳衍昌，范業鵬，孫秀玲，等. 口腔腫瘤惡變與唾液蔗糖酶活性的相關性研究[J]. 黑龍江醫學，2000，7（7）：3-5.

[7]余瑞元，倪逸聲，王林，等. 大鼠、小鼠胰蛋白酶的分離純化及動力學性質[J]. 生物化學雜志，1993，9（6）：659-663.

[8]楊翠竹，李艷，阮南，等. 酵母細胞破壁技術研究與應用進展[J]. 食品科技，2006，31（7）：138-142.

[9]李宏君，尹際彤，楊啟東. 細胞破碎方法簡述[J]. 黑龍江醫藥，2002，15（2）：124.

[10]嚴娟，蔡志翔，張斌斌，等. 桃果肉總酚提取和測定方法的研究[J]. 江蘇農業學報，2013，29（3）：642-647.

[11]蔣彥婕，吳紀中，張巧鳳，等. 紫小麥麩皮花色苷提取工藝及其結構[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1146-1151.

[12]鄭學玲，李利民，姚惠源.小麥麩皮水溶性戊聚糖的分離及分級純化[J]. 無錫輕工大學學報：食品與生物技術，2004，23（2）：1-4.

[13]Miller G L. Use of DinitrosaIicylic acid reagent invertase for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959（31）：426-428.

[14]徐樺，陸珊華，孫愛民. 酵母蔗糖酶Km值的測定[J]. 南京醫科大學學報：自然科學版，1999，19（4）：329-331.

[15]戴佳錕，李燕，馬齊，等. 從畢赤酵母中提取外源重組蛋白的超聲破碎條件及優化[J]. 食品科學，2012，33（10）：57-60.endprint

摘要：采用單因素試驗和L9（33）正交試驗確定釀酒酵母的最佳超聲破碎條件。結果表明，釀酒酵母的最佳超聲破碎條件為：破碎功率350 W、總工作時間25 min、工作時間/間歇時間15 s/25 s。

關鍵詞：酵母細胞；蔗糖酶；酶活性；超聲破碎法；正交試驗

中圖分類號： TS201.2+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0237-03

收稿日期：2013-08-26

作者簡介：李聰（1984—），女，遼寧撫順人，碩士研究生，助理實驗師，研究方向為食品微生物發酵。E-mail：lcfayewong@126.com。蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）別稱轉化酶，能催化蔗糖水解產生葡萄糖、果糖，是一種廣泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。目前蔗糖酶已在農產品加工業[2]、食品工業[3-4]、醫藥行業[5-6]中發揮重要作用。工業上一般從酵母中提取蔗糖酶[7]。蔗糖酶屬于胞內水解酶，提取時須對酵母細胞進行破壁處理，酵母細胞的破壁方法主要有機械研磨法、酶解法、反復凍融法等[8]，這些方法都有一些不足之處，例如酶解法耗時長、費用高，機械研磨法操作復雜、損耗大等[9]。超聲波具有空化效應，會產生機械剪切壓力而使細胞破碎[10-11]。本研究采用超聲波法破碎酵母細胞，以期找出有效保存酵母蔗糖酶活性的超聲破碎條件。

1材料與方法

1.1菌株

釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）GY 7，由遼寧石油化工大學化學化工與環境學部實驗室保存。

1.2培養基

種子培養基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 15 g/L，氯化鈉4 g/L，pH值 7.0。

搖瓶發酵培養基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 1 g/L，pH 值5.5。

1.3儀器設備

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；全溫振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技生物有限公司）。

1.4方法

1.4.1釀酒酵母的培養及收集向裝有30 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶中接種兩環斜面種子，30 ℃、150 r/min 振蕩培養24 h，得到二級種子液。將二級種子液以10%的接種量接入100 mL發酵培養基中，29 ℃、搖床轉速160 r/min條件下培養27 h左右。取菌液于4 000 r/min離心10 min，得到酵母菌體細胞。

1.4.2超聲破碎釀酒酵母將離心得到的菌體用pH值4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液沖洗2次，取菌體1 g，加入到50 mL緩沖液中充分振蕩混勻制成菌懸液，在超聲細胞破碎儀中破碎，破碎條件按單因素試驗和正交試驗表進行。

1.4.3酵母蔗糖酶的提取 將超聲破碎后細胞懸濁液于 12 000 r/min 離心20 min，得到上清即為粗酶液。向粗酶液中加入乙醇使其質量分數達30%，4 ℃放置過夜，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，再追加投入乙醇使其終質量分數達50%。4 ℃放置1 h，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用雙蒸水溶解，4 ℃保存[12]。

3結論與討論

釀酒酵母細胞壁較厚，在超聲破碎過程中超聲功率的選擇非常重要，功率較小影響酵母細胞破碎率，導致酵母蔗糖酶活力較低；而功率過大則會引起細胞懸液飛濺或產生泡沫。

超聲破碎的工作時間/間歇時間對蔗糖酶活力有顯著影響，當超聲破碎時間大于間歇時間時，超聲破碎過程中產生了較多熱量，而較短的間歇時間使熱量無法散發，從一定程度上破壞了蔗糖酶活性。因此設定工作時間/間歇時間時，應使超聲時間短于間歇時間。

本研究以酵母蔗糖酶活力為指標，將超聲破碎功率、總工作時間、工作時間/間歇時間列為考察因素，通過單因素試驗及正交試驗探尋超聲破碎酵母細胞的最佳條件。試驗優化后的超聲破碎條件為超聲功率350 W，總工作時間25 min，工作時間/間歇時間15 s/25 s。優化后的超聲破碎酵母細胞法與酸堿裂解法、反復凍融法、酶解法相比，更為簡便、快捷、經濟、實用，適于實驗室及小規模的破碎酵母提取蔗糖酶等胞內活性物質試驗。

參考文獻：

[1]郭小路，張萬秋，闕瑞琦，等. 薄荷幼葉蔗糖酶的分離純化與部分性質[J]. 西南大學學報：自然科學版，2008，30（2）：90-94.

[2]梁東麗，谷潔，高華，等. 不同禽畜糞便靜態高溫堆肥過程中蔗糖酶活性的變化[J]. 農業環境科學學報，2009，28（7）：1535-1540.

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[4]陳冰，林軒，梁詩瑩，等. 蔗糖酶水解蔗糖的研究[J]. 湛江師范學院學報：自然科學版，1997，18（2）：57-60.

[5]陳維順，于皆平，沈志祥，羅和生.蔗糖酶作為大腸腺瘤惡變傾向標志的研究[J]. 中國腫瘤臨床，1996，23（8）：542-544.

[6]吳衍昌，范業鵬，孫秀玲，等. 口腔腫瘤惡變與唾液蔗糖酶活性的相關性研究[J]. 黑龍江醫學，2000，7（7）：3-5.

[7]余瑞元，倪逸聲，王林，等. 大鼠、小鼠胰蛋白酶的分離純化及動力學性質[J]. 生物化學雜志，1993，9（6）：659-663.

[8]楊翠竹，李艷，阮南，等. 酵母細胞破壁技術研究與應用進展[J]. 食品科技，2006，31（7）：138-142.

[9]李宏君，尹際彤，楊啟東. 細胞破碎方法簡述[J]. 黑龍江醫藥，2002，15（2）：124.

[10]嚴娟，蔡志翔，張斌斌，等. 桃果肉總酚提取和測定方法的研究[J]. 江蘇農業學報，2013，29（3）：642-647.

[11]蔣彥婕，吳紀中，張巧鳳，等. 紫小麥麩皮花色苷提取工藝及其結構[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1146-1151.

[12]鄭學玲，李利民，姚惠源.小麥麩皮水溶性戊聚糖的分離及分級純化[J]. 無錫輕工大學學報：食品與生物技術，2004，23（2）：1-4.

[13]Miller G L. Use of DinitrosaIicylic acid reagent invertase for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry，1959（31）：426-428.

[14]徐樺，陸珊華，孫愛民. 酵母蔗糖酶Km值的測定[J]. 南京醫科大學學報：自然科學版，1999，19（4）：329-331.

[15]戴佳錕，李燕，馬齊，等. 從畢赤酵母中提取外源重組蛋白的超聲破碎條件及優化[J]. 食品科學，2012，33（10）：57-60.endprint