微波提取高效液相色譜法測定花椰菜中的維生素C

摘要：研究微波輔助提取、反相高效液相色譜法測定花椰菜中維生素C含量的方法。將花椰菜勻漿后，以1%草酸為萃取劑，微波提取、凈化后，采用恒流的方法進(jìn)行液相色譜定量檢測，以0.1%草酸溶液為流動相，流速 1.0 mL/min，采用C18反相色譜柱分離，在254 nm波長下檢測。結(jié)果表明，維生素C濃度在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，檢測限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%。說明微波輔助法、反相高效液相色譜法能有效提取蔬菜中的維生素C，且測定結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可以用于蔬菜中維生素C的檢測。

關(guān)鍵詞：微波提取；高效液相色譜法；花椰菜；維生素C

中圖分類號： O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0256-02

收稿日期：2013-08-07

基金項目：江蘇省南通市農(nóng)村科技創(chuàng)新及產(chǎn)業(yè)化項目（編號：HL2012025）。

作者簡介：吳海燕（1978—），女，江蘇南通人，碩士，講師，主要從事食品綜合利用、食品安全檢測研究。Tel：（0513）81050523；E-mail：why022@126.com。維生素C別稱抗壞血酸，是維持人體正常生理代謝不可缺少的一類有機化合物，人體自身不能合成，必須由膳食供給，維生素C廣泛存在于新鮮的水果、蔬菜中[1]。花椰菜是十字花科蕓薹屬植物，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、食物纖維、維生素等。有研究表明，花椰菜中含有豐富的維生素C，長期食用能提高人體的免疫功能，促進(jìn)肝臟解毒；同時也能起到阻止癌前病變細(xì)胞形成的作用，從而可以從一定程度上預(yù)防癌癥[2]。維生素C含量的測定方法通常有以氧化還原為基礎(chǔ)的比色法或者以衍生反應(yīng)為基礎(chǔ)的熒光法[3]，但是這些方法所需的試劑多且操作復(fù)雜。由于維生素C有較強的還原作用，在處理時容易使樣品中的維生素C損失，從而影響測定的準(zhǔn)確度和精確度。高效液相色譜法具有高效、穩(wěn)定、可靠等特點，特別是在待測樣品較多的情況下，借助儀器分析能更快更準(zhǔn)確地進(jìn)行維生素C含量的測定。近年來已有一些報道用高效液相色譜法測定維生素C的含量[4-6]，但是在樣品制備過程中存在提取率低、操作繁瑣、萃取劑用量大等問題。微波提取是一種較新的樣品前處理方法，與傳統(tǒng)的提取法相比，其最大的優(yōu)點是提取的產(chǎn)品雜質(zhì)含量低、有效成分含量高且提取效率高[7]，目前這種新的微波提取技術(shù)已逐漸被應(yīng)用于天然植物有效成分、生物活性成分的提取研究中[8-12]。本研究以期建立微波提取、反相高效液相色譜法測定花椰菜中維生素C含量的方法，為花椰菜中維生素C的含量測定提供試驗資料。

1材料與方法

1.1主要試劑與材料

主要試劑為：甲醇，色譜純；維生素C、草酸等試劑，國產(chǎn)分析純；所有試驗用水均為超純水。主要試驗材料為：0.45 μm 濾膜，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；花椰菜，市售。

1.2主要儀器與設(shè)備

試驗用主要儀器與設(shè)備有Waters高效液相色譜儀、Waters1525泵、Waters2487紫外檢測器、Breeze色譜系統(tǒng)管理工作站、液相平頭微量進(jìn)樣器（Eppendorf）、HR2084食品制樣器（飛利浦）、CW-2000A型超聲-微波協(xié)同萃取儀（上海新拓）、Millipore超純水機、隔膜真空泵（天津騰達(dá)）、TU-1901紫外可見分光光度計（北京通用普析）、KQ3200超聲脫氣機（昆山市超聲儀器有限公司）、Symmetry C18色譜柱。

1.3試驗方法

1.3.1色譜條件Symmetry C18色譜柱柱長100 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，顆粒大小5.0 μm，檢測波長254 nm，流動相為0.1% （體積分?jǐn)?shù)）草酸溶液，流速1 mL/min，進(jìn)樣量25 μL，柱溫 25 ℃；以保留時間定性，待液相色譜穩(wěn)定后進(jìn)樣分析，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.3.2樣品處理稱取100 g花椰菜樣品，迅速切碎后置于食品制樣器中，加入100 mL 2%草酸溶液制成勻漿。準(zhǔn)確稱取5.00 g勻漿樣品，以30 mL 1%草酸為萃取溶劑，微波功率設(shè)為200 W，萃取時間為15 min，萃取溫度設(shè)定為45 ℃，平行萃取2次[6]。萃取液過濾后，用1%草酸溶液定容至50 mL制成待測液。待測液用0.45 μm濾膜過濾后按“1.3.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC測定。

1.3.3線性關(guān)系分析維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取20 mg維生素C對照品，用0.1%草酸溶解后轉(zhuǎn)移至 100 mL 棕色容量瓶中，定容并制成維生素C標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再分別準(zhǔn)確量取1、2、3、4、5、6 mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)儲備液于 10 mL 棕色容量瓶中，用0.1%草酸溶解并定容，分別制成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm濾膜過濾后按“1.3.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC測定。每個濃度進(jìn)樣3次，以平均峰面積的積分值對進(jìn)樣濃度（mg/mL）進(jìn)行直線回歸。

1.3.4精密度試驗取所制得樣品，按照“1.3.1”節(jié)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定維生素C的精密度。

1.3.5回收率試驗采用加樣回收法，精密稱取適量勻漿樣品，加入維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.3.2”節(jié)方法進(jìn)行處理，按含量測定方法測定維生素C的回收率。

1.3.6最低檢測限的計算以產(chǎn)生3倍儀器噪聲水平的進(jìn)樣量為檢出限[13]。

2結(jié)果與分析

2.1色譜分離結(jié)果

液相色譜分離效果的主要影響因素為色譜柱的類別、流動相、流速。在“1.3.1”的色譜條件下，維生素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液、花椰菜樣品的色譜圖分別見圖1、圖2，可以看出所有樣品均能實現(xiàn)基線分離，而且峰形能滿足測定要求，維生素C的保留時間為2.868 min，檢測限為0.02 mg/kg。endprint

2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以3次進(jìn)樣的平均峰面積為響應(yīng)值，以維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度（mg/mL）為自變量，求得直線回歸方程為：y=876 060x+2 750.9，r2=0.999 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02～0.12 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

2.3精密度試驗

將同一花椰菜樣品按照“1.3.1”中的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測得花椰菜中維生素C的含量分別為632.0、637.7、635.2、650.8、641.8、649.5 mg/kg，平均含量為641.2 mg/kg，本測定試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%，表明本方法的精密度高，重現(xiàn)性較好。

2.4回收率試驗

分別稱取3份5.00 g勻漿的花椰菜樣品，分別加入1、2、5 mL的0.20 mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.3.2”節(jié)方法提取，按“1.3.1”節(jié)的色譜條件測定維生素C含量，每個混合樣品測定3次，取平均值。結(jié)果（表1）表明，3個不同添加量試樣的回收率在99.9%～104.6%之間，平均回收率102.4%，表明采用微波提取、反相高效液相色譜法測定花椰菜中維生素C含量的方法準(zhǔn)確度好，符合色譜定量分析的準(zhǔn)確度要求。

3結(jié)論

本試驗采用微波輔助提取，過濾后用液相測定方法來測定花椰菜中維生素C含量。結(jié)果表明，本方法的線性范圍為0.02～0.12 mg/mL，檢測限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之間，平均回收率為102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為120%。由于維生素C性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化，采用微波輔助提取，不但加快了提取進(jìn)程，縮短了樣品制備時間，避免維生素C的損失，同時有效提取樣品中的維生素C，測定的準(zhǔn)確度和精密度好，可用于蔬菜中維生素C含量的定量測定。

參考文獻(xiàn)：

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[13]吳海燕，陳建軍.蔬菜中多種有機磷農(nóng)藥殘留氣相色譜分析法[J]. 食品與機械，2010，26（4）：76-77，83.endprint

2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以3次進(jìn)樣的平均峰面積為響應(yīng)值，以維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度（mg/mL）為自變量，求得直線回歸方程為：y=876 060x+2 750.9，r2=0.999 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02～0.12 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

2.3精密度試驗

將同一花椰菜樣品按照“1.3.1”中的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測得花椰菜中維生素C的含量分別為632.0、637.7、635.2、650.8、641.8、649.5 mg/kg，平均含量為641.2 mg/kg，本測定試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%，表明本方法的精密度高，重現(xiàn)性較好。

2.4回收率試驗

分別稱取3份5.00 g勻漿的花椰菜樣品，分別加入1、2、5 mL的0.20 mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.3.2”節(jié)方法提取，按“1.3.1”節(jié)的色譜條件測定維生素C含量，每個混合樣品測定3次，取平均值。結(jié)果（表1）表明，3個不同添加量試樣的回收率在99.9%～104.6%之間，平均回收率102.4%，表明采用微波提取、反相高效液相色譜法測定花椰菜中維生素C含量的方法準(zhǔn)確度好，符合色譜定量分析的準(zhǔn)確度要求。

3結(jié)論

本試驗采用微波輔助提取，過濾后用液相測定方法來測定花椰菜中維生素C含量。結(jié)果表明，本方法的線性范圍為0.02～0.12 mg/mL，檢測限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之間，平均回收率為102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為120%。由于維生素C性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化，采用微波輔助提取，不但加快了提取進(jìn)程，縮短了樣品制備時間，避免維生素C的損失，同時有效提取樣品中的維生素C，測定的準(zhǔn)確度和精密度好，可用于蔬菜中維生素C含量的定量測定。

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2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以3次進(jìn)樣的平均峰面積為響應(yīng)值，以維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度（mg/mL）為自變量，求得直線回歸方程為：y=876 060x+2 750.9，r2=0.999 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02～0.12 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

2.3精密度試驗

將同一花椰菜樣品按照“1.3.1”中的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測得花椰菜中維生素C的含量分別為632.0、637.7、635.2、650.8、641.8、649.5 mg/kg，平均含量為641.2 mg/kg，本測定試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%，表明本方法的精密度高，重現(xiàn)性較好。

2.4回收率試驗

分別稱取3份5.00 g勻漿的花椰菜樣品，分別加入1、2、5 mL的0.20 mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.3.2”節(jié)方法提取，按“1.3.1”節(jié)的色譜條件測定維生素C含量，每個混合樣品測定3次，取平均值。結(jié)果（表1）表明，3個不同添加量試樣的回收率在99.9%～104.6%之間，平均回收率102.4%，表明采用微波提取、反相高效液相色譜法測定花椰菜中維生素C含量的方法準(zhǔn)確度好，符合色譜定量分析的準(zhǔn)確度要求。

3結(jié)論

本試驗采用微波輔助提取，過濾后用液相測定方法來測定花椰菜中維生素C含量。結(jié)果表明，本方法的線性范圍為0.02～0.12 mg/mL，檢測限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之間，平均回收率為102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為120%。由于維生素C性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化，采用微波輔助提取，不但加快了提取進(jìn)程，縮短了樣品制備時間，避免維生素C的損失，同時有效提取樣品中的維生素C，測定的準(zhǔn)確度和精密度好，可用于蔬菜中維生素C含量的定量測定。

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