小駁骨中總黃酮、總酚酸含量測定及其抗氧化活性研究

陳燕霞等

摘要：采用紫外-可見分光光度法測定小駁骨不同提取溶劑、不同部位總黃酮和總酚酸含量及其抗氧化性。結(jié)果表明，小駁骨莖總黃酮含量高于葉，莖水提取液總黃酮含量最高，為4.26%；小駁骨葉總酚酸含量高于莖，葉醇提取液總酚酸含量最高，為11.90%；在抗氧化性方面，莖水提液>莖醇提液>葉水提液>葉醇提液；小駁骨不同部位總黃酮、總有機(jī)酸含量、抗氧化性存在差異；總黃酮含量和抗氧化性具有相關(guān)性，表明抗氧化活性可能與黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：小駁骨； 總黃酮； 總酚酸； 抗氧化性

中圖分類號： R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0258-02

收稿日期：2013-10-14

作者簡介：陳燕霞（1988—），女，廣東汕頭人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幣谥片F(xiàn)代化、中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail：973414396@qq.com。

通信作者：陳康，男，廣東陽江人，教授，研究方向?yàn)橹兴幣谥片F(xiàn)代化、中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化及中藥新藥研究。E-mail：chenkang@gzucm.edu.cn。小駁骨（Gendarussa vulgaris Nees.）別名駁骨丹、接骨草、四季花、小還魂、百節(jié)芒、小葉金不換、小接骨草、裹籬樵、長生木、細(xì)骨風(fēng)等，為雙子葉植物爵床科小駁骨屬植物小駁骨的干燥地上部分，全年均可采收，廣泛分布于我國的廣東、廣西、海南等地。小駁骨性味辛、溫，歸肝、腎經(jīng)；功能為祛瘀止痛，續(xù)筋接骨；主用于跌打損傷，筋傷骨折，風(fēng)濕骨痛，血瘀經(jīng)閉，產(chǎn)后腹痛[1]。民間常取小駁骨鮮品搗爛，或用酒調(diào)后熱敷患處。據(jù)報(bào)道，小駁骨含有揮發(fā)油、無機(jī)元素、生物堿、黃酮苷、有機(jī)酸、糖類、氨基酸等[2-4]；盧勝明研究了小駁骨地上部分的95%乙醇提取物的化學(xué)成分，從中分離并鑒定了19個(gè)化合物[5]；江秀娟等對小駁骨藥材進(jìn)行了性狀鑒別、顯微鑒別、薄層鑒別，對水分、總灰分、水溶性浸出物含量等進(jìn)行了測定[6]。但目前關(guān)于小駁骨藥材的研究較少。本研究測定了小駁骨中總黃酮、總酚酸含量，并體外測定其抗氧化活性，以期為制定小駁骨的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其全面開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

小駁骨飲片購于廣東康美藥業(yè)股份有限公司康美中藥飲片廠，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)炮制教研室陳康教授鑒定為爵床科小駁骨屬植物小駁骨。

蕓香苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707）；咖啡酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：110807）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：D0909）；無水乙醇為分析純；水為蒸餾水。

主要儀器：電子天平（上海精科天平有限公司，型號為MP200B）、8453E紫外-可見分光光度計(jì)（美國Agilent科技公司）、超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司，型號為KQ-300）。

1.2方法

1.2.1樣品溶液制備（1）醇提液：分別稱取小駁骨莖、葉粉末樣品約2 g，置于100 mL錐形瓶中，加60%乙醇溶液 60 mL，超聲提取40 min，冷卻后補(bǔ)足重量差異，過濾即得。（2）水提液：分別稱取小駁骨莖、葉粉末樣品約2 g，置于 150 mL 圓底燒瓶中，加60 mL蒸餾水，回流提取1 h，冷卻后補(bǔ)足重量差異，過濾即得。

1.2.2水分含量測定按照《中國藥典》（2010年版）相關(guān)要求測定小駁骨藥材含水量。

1.2.3總黃酮含量測定

1.2.3.1蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系進(jìn)行顯色分析[7]。稱取干燥至恒重的蕓香苷對照品2.07 mg，用乙醇溶解置于10 mL容量瓶，定容，即得蕓香苷對照品溶液（0.207 mg/mL）。分別移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL蕓香苷對照品溶液于10 mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.3 mL，混勻，放置6 min；加10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加1%NaOH溶液4 mL，用乙醇定容至刻度線，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)試劑為空白，在 510 nm 波長處測定吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次。以蕓香苷對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2總黃酮含量測定分別移取樣品溶液5 mL于 10 mL 容量瓶中，按上述NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系方法進(jìn)行操作，在510 nm波長處測定吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次，根據(jù)蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總黃酮含量。

1.2.4總酚酸含量測定

1.2.4.1咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制采用鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色體系進(jìn)行顯色分析[8]。稱取干燥至恒重的咖啡酸對照品1.45 mg，用乙醇溶解置于10 mL容量瓶，定容，即得咖啡酸對照品溶液（0.145 g/L）。分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于25 mL容量瓶中，加乙醇至5 mL，加0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL及0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀混合溶液（V ∶V=1 ∶1）1 mL，混勻，在暗處放置5 min，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，避光放置20 min。以相應(yīng)試劑為空白，在 736 nm 波長處測定吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次。以咖啡酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2總酚酸含量測定移取樣品溶液0.2 mL于25 mL容量瓶中，按上述鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色體系方法進(jìn)行操作，在736 nm波長處測定吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次，根據(jù)咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品總酚酸含量。

1.2.5對DPPH清除活性的測定參照文獻(xiàn)中方法[9-11]并作改進(jìn)，測定樣品對DPPH清除活性。稱取DPPH對照品 8 mg，用無水乙醇定容至100 mL的容量瓶中，配制成濃度為 0.08 g/L 的DPPH溶液，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。分別吸取樣品溶液4 mL至25 mL容量瓶中，定容，搖勻。取稀釋后的樣品溶液3 mL，加入2 mL DPPH溶液，搖勻，室溫、避光放置 30 min。以無水乙醇代替 DPPH 溶液為對照，以無水乙醇代替樣品提取液作空白。在521 nm波長處測吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除率。endprint

DPPH清除率=（1-（D1-D2）D0）×100%

式中：D0為3 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液處理的吸光度；D1為3 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液處理的吸光度；D2為3 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇處理的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1小駁骨藥材水分含量

2.3對DPPH自由基的清除作用

試驗(yàn)表明，小駁骨莖醇提液、葉醇提液、莖水提液、葉水提液對DPPH自由基的清除率分別為67.8%、51.5%、82.6%、60.3%。小駁骨各樣品溶液對DPPH均有一定的清除能力，且對DPPH自由基的清除能力有差異。清除能力由強(qiáng)到弱分別為莖水提液>莖醇提液>葉水提液>葉醇提液，其中莖水提液清除能力最強(qiáng)，為82.6%。

3結(jié)論與討論

由于合成抗氧化劑對人類健康的潛在危害，近年來從天然植物中尋找天然抗氧化劑引起了人們極大的興趣。以往的研究表明，傳統(tǒng)中藥材具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并且目前已知的抗氧化物質(zhì)多為黃酮類和酚酸類成分。因此本研究采用了經(jīng)典的顯色體系NaNO2-Al（NO3）3-NaOH和鐵氰化鉀-三氯化鐵，檢測了小駁骨藥材中不同提取溶劑、不同部位的總黃酮、總酚酸含量。其中莖水提液總黃酮含量最高，為4.26%，葉醇提液總酚酸含量最高，為11.90%。

DPPH法是常用的檢測化合物清除自由基活性的方法。本研究顯示，小駁骨各樣品溶液對DPPH均有一定的清除能力，且對DPPH自由基的清除能力有差異。不同樣品中總黃酮含量高低與不同樣品對DPPH清除率強(qiáng)弱的規(guī)律是一致的，可以推測小駁骨中總黃酮在清除DPPH自由基中發(fā)揮主要的作用，這也與以往研究結(jié)果[12]一致。此外，小駁骨是療效確切、顯著的民間常用藥，同時(shí)被作為綠籬廣泛種植，藥材來源豐富。為了提高小駁骨的綜合利用度，還應(yīng)對小駁骨的抗氧化活性部位進(jìn)行活性成分篩選，為今后開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會. 中國藥典：一部[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：44.

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[4]劉文粢，黃愛東，顧熊飛.小駁骨丹無機(jī)元素的含量測定[J]. 廣東微量元素科學(xué)，2002，9（8）：57-58.

[5]盧勝明. 五楓藤、小駁骨和川西茶藨的化學(xué)成分研究[D]. 成都：中國科學(xué)院成都生物研究所，2008.

[6]江秀娟，林惠蓉，陳新.中藥材小駁骨的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 臨床醫(yī)學(xué)工程，2009，16（10）：26-28.

[7]馬陶陶，張群林，李俊.中藥總黃酮的含量測定方法[J]. 安徽醫(yī)藥，2007，11（11）：1030-1032.

[8]馬強(qiáng)，董玉，那生桑，等. 冬葵果中總酚酸的含量測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）：2583-2584.

[9]Chen W，Weng Y M，Tseng C Y. Antioxidative and antimutagenic activities of healthy herbal drinks from Chinese medicinal herbs[J]. The American Journal of Chinese Medicine，2003，31（4）：523-532.

[10]彭長連，陳少薇，林植芳，等. 用清除有機(jī)自由基DPPH法評價(jià)植物抗氧化能力[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（6）：658-661.

[11]李忠紅，胡浩彬，杜冠華. 天然蟲草和人工蟲草菌絲體的抗氧化活性比較研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5（16）：13-16.

[12]烏蘭格日樂，白海泉，翁慧. 黃酮的抗氧化活性研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，23（3）：277-280.endprint

DPPH清除率=（1-（D1-D2）D0）×100%

式中：D0為3 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液處理的吸光度；D1為3 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液處理的吸光度；D2為3 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇處理的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1小駁骨藥材水分含量

2.3對DPPH自由基的清除作用

試驗(yàn)表明，小駁骨莖醇提液、葉醇提液、莖水提液、葉水提液對DPPH自由基的清除率分別為67.8%、51.5%、82.6%、60.3%。小駁骨各樣品溶液對DPPH均有一定的清除能力，且對DPPH自由基的清除能力有差異。清除能力由強(qiáng)到弱分別為莖水提液>莖醇提液>葉水提液>葉醇提液，其中莖水提液清除能力最強(qiáng)，為82.6%。

3結(jié)論與討論

由于合成抗氧化劑對人類健康的潛在危害，近年來從天然植物中尋找天然抗氧化劑引起了人們極大的興趣。以往的研究表明，傳統(tǒng)中藥材具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并且目前已知的抗氧化物質(zhì)多為黃酮類和酚酸類成分。因此本研究采用了經(jīng)典的顯色體系NaNO2-Al（NO3）3-NaOH和鐵氰化鉀-三氯化鐵，檢測了小駁骨藥材中不同提取溶劑、不同部位的總黃酮、總酚酸含量。其中莖水提液總黃酮含量最高，為4.26%，葉醇提液總酚酸含量最高，為11.90%。

DPPH法是常用的檢測化合物清除自由基活性的方法。本研究顯示，小駁骨各樣品溶液對DPPH均有一定的清除能力，且對DPPH自由基的清除能力有差異。不同樣品中總黃酮含量高低與不同樣品對DPPH清除率強(qiáng)弱的規(guī)律是一致的，可以推測小駁骨中總黃酮在清除DPPH自由基中發(fā)揮主要的作用，這也與以往研究結(jié)果[12]一致。此外，小駁骨是療效確切、顯著的民間常用藥，同時(shí)被作為綠籬廣泛種植，藥材來源豐富。為了提高小駁骨的綜合利用度，還應(yīng)對小駁骨的抗氧化活性部位進(jìn)行活性成分篩選，為今后開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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[12]烏蘭格日樂，白海泉，翁慧. 黃酮的抗氧化活性研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，23（3）：277-280.endprint

DPPH清除率=（1-（D1-D2）D0）×100%

式中：D0為3 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液處理的吸光度；D1為3 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液處理的吸光度；D2為3 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇處理的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1小駁骨藥材水分含量

2.3對DPPH自由基的清除作用

試驗(yàn)表明，小駁骨莖醇提液、葉醇提液、莖水提液、葉水提液對DPPH自由基的清除率分別為67.8%、51.5%、82.6%、60.3%。小駁骨各樣品溶液對DPPH均有一定的清除能力，且對DPPH自由基的清除能力有差異。清除能力由強(qiáng)到弱分別為莖水提液>莖醇提液>葉水提液>葉醇提液，其中莖水提液清除能力最強(qiáng)，為82.6%。

3結(jié)論與討論

由于合成抗氧化劑對人類健康的潛在危害，近年來從天然植物中尋找天然抗氧化劑引起了人們極大的興趣。以往的研究表明，傳統(tǒng)中藥材具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并且目前已知的抗氧化物質(zhì)多為黃酮類和酚酸類成分。因此本研究采用了經(jīng)典的顯色體系NaNO2-Al（NO3）3-NaOH和鐵氰化鉀-三氯化鐵，檢測了小駁骨藥材中不同提取溶劑、不同部位的總黃酮、總酚酸含量。其中莖水提液總黃酮含量最高，為4.26%，葉醇提液總酚酸含量最高，為11.90%。

DPPH法是常用的檢測化合物清除自由基活性的方法。本研究顯示，小駁骨各樣品溶液對DPPH均有一定的清除能力，且對DPPH自由基的清除能力有差異。不同樣品中總黃酮含量高低與不同樣品對DPPH清除率強(qiáng)弱的規(guī)律是一致的，可以推測小駁骨中總黃酮在清除DPPH自由基中發(fā)揮主要的作用，這也與以往研究結(jié)果[12]一致。此外，小駁骨是療效確切、顯著的民間常用藥，同時(shí)被作為綠籬廣泛種植，藥材來源豐富。為了提高小駁骨的綜合利用度，還應(yīng)對小駁骨的抗氧化活性部位進(jìn)行活性成分篩選，為今后開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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[4]劉文粢，黃愛東，顧熊飛.小駁骨丹無機(jī)元素的含量測定[J]. 廣東微量元素科學(xué)，2002，9（8）：57-58.

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[7]馬陶陶，張群林，李俊.中藥總黃酮的含量測定方法[J]. 安徽醫(yī)藥，2007，11（11）：1030-1032.

[8]馬強(qiáng)，董玉，那生桑，等. 冬葵果中總酚酸的含量測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）：2583-2584.

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[10]彭長連，陳少薇，林植芳，等. 用清除有機(jī)自由基DPPH法評價(jià)植物抗氧化能力[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（6）：658-661.

[11]李忠紅，胡浩彬，杜冠華. 天然蟲草和人工蟲草菌絲體的抗氧化活性比較研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5（16）：13-16.

[12]烏蘭格日樂，白海泉，翁慧. 黃酮的抗氧化活性研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，23（3）：277-280.endprint