亞硝化細菌培養條件的優化

董玉瑋等

摘要：以活性污泥中分離出的亞硝化的細菌為研究對象，對亞硝化菌培養條件（培養溫度、pH、碳源、氮源、刺激因子）進行優化。結果表明：亞硝化細菌最佳培養溫度為30 ℃，最佳培養基pH值為8.0，外加碳源Na2CO3最佳濃度為0.2%，NH4HCO3最佳濃度為0.2%，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在此最佳培養條件下，亞硝化細菌生長及亞硝酸鹽氮富集能力達到最高，為185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%；采用三角瓶半連續式培養的亞硝化細菌脫氮性能優于量筒培養的，而連續式培養較半連續式培養能更有利于亞硝化細菌菌群數量的增長和繁殖。

關鍵詞：亞硝化細菌；培養條件；優化

中圖分類號： X172 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0314-03

收稿日期：2013-08-19

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK2011201）；徐州工程學院科技計劃（編號：XKY2012216）。

作者簡介：董玉瑋（1980—），男，江蘇徐州人，博士，講師，主要從事環境微生物學研究。E-mail：dongyuwei66@163.com。

通信作者：張雁秋，教授。E-mail：yanqiuzhang66@163.com。亞硝化細菌在自然界分布十分普遍，土壤、淡水及海洋中都有亞硝化細菌的存在，能將氨氧化成亞硝酸，屬于硝化細菌科兩個生理亞群之一[1]，在硝化作用第一步即由銨鹽氧化為亞硝酸鹽的過程中起作用，同時也是其第一個限速反應[2-3]。亞硝化細菌與人類的關系十分密切，被廣泛應用于食品、生物、醫藥工業廢水凈化，城市污水處理，魚類養殖，農作物土壤改良等方面[4-5]。亞硝化細菌的生長代謝過程極其緩慢，在適宜的條件下一般需要24 h才能完成1次分裂周期。在進行固體培養過程中甚至需數月才能長出菌落。亞硝化細菌是嚴格的專性化異養菌，以銨鹽的氧化滿足其能量的需要。在純培養的情況下，培養基中若加入有機物質將會抑制亞硝化細菌的生長，但是自然環境中有機物質對亞硝化細菌的影響不如在純培養中的大。亞硝化細菌對培養基組成、pH值和溫度等的改變都敏感[6]。本試驗研究碳源、氮源、溫度、刺激因子、pH對亞硝化細菌生長及亞硝酸鹽富集能力的影響，對亞硝化細菌培養條件進行優化。

1材料和方法

1.1材料

亞硝化細菌從中國礦業大學環境與測繪學院實驗室活性污泥中富集分離獲得，經鑒定為Nitrosomonas sp.[7]，經不斷選育后該菌種亞硝酸鹽富集能力較強。

1.2方法

1.2.1培養基亞硝化細菌富集培養基[8]：0.4%（NH4）2SO4 、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4、0.2% NaCl、004% FeSO4，0.5% CaCO3 混勻溶解。調節pH值至8.0～8.2。亞硝化細菌液體培養基：亞硝化細菌富集培養基稀釋5倍，即為亞硝化細菌液體培養基，其中NH+4-N濃度為 206 mg/L。

1.2.2亞硝化細菌培養條件優化

1.2.2.1溫度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養基，于500 mL搖瓶中，調pH值為8，在15、25、30、35、40 ℃下，110 r/min搖床培養。

1.2.2.2Na2CO3濃度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養基，于500 mL搖瓶中，調pH值為8，分別加入0.1%、0.2%、0.4%，1%Na2CO3，110 r/min，最適溫度下搖床培養。

1.2.2.3NH4HCO3濃度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養基，于500 mL搖瓶中，調pH值為8，分別加入0.02%、0.1%、0.2%、0.3% NH4HCO3，110 r/min，最適溫度，最適Na2CO3濃度下搖床培養。

1.2.2.4刺激因子（氯化鑭）濃度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養基，分別加入0.001%、0.002%、0.004%、0.008%、0.01%、0.02% LaCl3，110 r/min、最適溫度、最適Na2CO3濃度、最適NH4HCO3濃度下搖床培養。

1.2.2.5pH值選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養基，于500 mL搖瓶中，分別于pH 6、7、8、9、10條件下，110 r/min，最適溫度，最適Na2CO3濃度，最適NH4HCO3濃度，最適LaCl3濃度下搖床培養。

1.2.3亞硝化細菌培養方式的改進

1.2.3.1亞硝化細菌的半連續式培養采用最佳培養基，接種亞硝化細菌300 mL菌液分別于1 L三角瓶和1 L量筒中，不斷曝氣。30 ℃恒溫培養38～40 d，每7 d更換新的培養基，每2 d測定其亞硝酸態氮的含量。

1.2.3.2亞硝化細菌的連續式培養取300 mL亞硝化細菌菌體，接種于1 L三角瓶中，加滿亞硝化細菌最佳培養基，30 ℃ 連續式培養，每2 d測定其亞硝酸態氮的含量。

1.2.4檢測方法[9]亞硝態氮含量的測定采用α-萘胺分光光度法；銨態氮含量的測定采用納氏試劑分光光度法；硝態氮含量的測定采用酚二磺酸分光光度法。

2結果與分析

2.1溫度對亞硝化細菌培養的影響

分別于15、25、30、35、40 ℃下，120 r/min培養亞硝化細菌18 d。從圖1可知，隨著培養時間的增加，不同溫度下亞硝態氮含量都是先增加后趨于平緩。溫度過低時，亞硝化細菌的生長代謝緩慢，隨著溫度升高，亞硝化細菌細胞內的生化反應加快，促進了亞硝態氮的生成。當溫度為30 ℃時，亞硝態氮濃度最高，為160.71 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養最佳溫度為30 ℃，這與 Hyungseok 的研究結果[10]一致。endprint

2.2pH值對亞硝化細菌培養的影響

從圖2可知，隨著培養時間的增加，不同pH值下亞硝態氮含量都是先增加后趨于平緩。亞硝化細菌適宜在偏堿性條件下生長，pH偏低時，其活性受到影響，隨著pH值的升高，亞硝化細菌變得活躍。當pH值為8.0時，亞硝態氮濃度最高，為172.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養最佳pH值為8.0，這與廖雪義[11]等的研究結果一致。

2.3Na2CO3濃度對亞硝化細菌培養的影響

亞硝化細菌以無機碳源為唯一碳源，因此培養體系中無機碳源的含量會對亞硝化細菌的生長產生影響。自然界中無機碳主要以CO2、HCO-3、CO2-33種形式存在，不同形式的無機碳源對亞硝化細菌的生長影響有一定影響，原來液體培養基以CaCO3為唯一碳源，由于CaCO3較難溶解，碳源釋放不足，因此補加易溶解的Na2CO3以提供更多的碳源供亞硝化細菌生長所需。

從圖3可知，隨著培養時間的增加，不同濃度Na2CO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當Na2CO3濃度為0.2%時，亞硝態氮濃度最高，為171.44 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌液體培養基中最佳Na2CO3濃度為0.2%。

2.4NH4HCO3濃度對亞硝化細菌培養的影響

以NH+4為氮源最適合亞硝化細菌的生長，即硝化作用效率最高。NH4HCO3不但能提供NH+4形式氮源，且能提供HCO-3形式碳源，有利于亞硝化細菌獲得更多形式的碳源。

從圖4可知，隨著培養時間的增加，不同濃度的NH4HCO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當氮源較少時，無法滿足亞硝化細菌的生長需要，過多則會對亞硝化細菌有一定的刺激，硝化作用反而受到抑制。當NH4HCO3濃度為0.2%時，亞硝態氮濃度最高，為179.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌最佳NH4HCO3濃度為0.2%，這與楊代金等[12]的研究結果相近。

2.5刺激因子LaCl3對亞硝化細菌培養的影響

LaCl3對亞硝化細菌酶的作用與其濃度有關，當濃度較低時對酶具有變構激活作用，而濃度高時對酶具有抑制作用。在一定的LaCl3含量范圍內，亞硝化速率隨LaCl3含量的增加而增大。當LaCl3濃度為0.004%時，亞硝態氮濃度最高，為183.12 mg/L，當LaCl3濃度超過0.004%時，反而對亞硝態氮的積累有抑制作用（圖5）。

在加入0.2%Na2CO3、0.2% NH4HCO3、0.004% LaCl3的液體培養基中培養亞硝化細菌，pH值8.0，30 ℃，110 r/min培養10 d，每1 d測定亞硝態氮、銨態氮、硝態氮的含量，結果見圖6。

從圖6可以看出，在最佳培養條件下，隨著培養時間的增加，亞硝態氮含量逐漸增加，最高達185.36 mg/L，銨態氮去除率達到92.52%，硝態氮含量始終保持在較低水平，說明經過優化培養后，該亞硝化細菌的脫氮性能較好。

2.6培養方式對亞硝化細菌生長的影響

從圖7可以看出，在半連續培養中，隨著培養時間的增加，在三角瓶和量筒中進行半連續培養的亞硝化細菌，其脫氮性能總體呈增加趨勢。在每次更換培養基之前，亞硝態氮含量逐漸增加。第一次更換培養基前的亞硝態氮最高含量分別為86.04 mg/L和80.11 mg/L，最后一次更換培養基后，亞硝態氮的含量最高，分別達到174.17 mg/L和156.33 mg/L，分別增加了50.60%和48.75%。同時采用三角瓶培養的亞硝化細菌脫氮性能優于量筒培養的。原因可能是：（1）三角瓶底部空間較大，有利于亞硝化細菌生長和營養物質的傳遞，量筒底部狹小，不利于亞硝化細菌大量繁殖，也不利于營養物質順利輸送；（2）由于亞硝化細菌對氧氣需求較低，三角瓶自下而上空間逐漸縮小，阻礙了過多的氧氣進入，從而更有利于亞硝化細菌生長。

從圖8可知，經過連續式培養，亞硝化細菌的亞硝態氮含量總體呈增加的趨勢，最大值達到202.56 mg/L，40 d時亞硝態氮含量為178.08 mg/L，略高于半連續培養的亞硝態氮含量（174.17 mg/L），但連續式培養較半連續式培養操作更方便，同時能夠較好地有利于亞硝化細菌菌群數量的增長和繁殖，可為今后亞硝化細菌實驗室的擴大化培養提供參考。

3結論

本試驗優化后的亞硝化細菌液體培養條件為0.2%NH4HCO3，0.2%Na2CO3，pH值8.0，溫度30 ℃，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在最佳培養條件下，亞硝化細菌富集亞硝態氮能力最高，可達185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%。連續式培養較半連續式培養能更有利于亞硝化細菌菌群數量的增長和繁殖，且更方便。

參考文獻：

[1]Woses C R，Weisburg W G，Paster B J. The phylogeny of purple baeteria：the alpha subdivision[J]. Systematic and Applied Microbiology，1984，5（3）：327-336.

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[5]Yu J，Yang M，Qi R，et al. Community structures of ammonia-oxidizing bacteria in different municipal wastewater treatment systems[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，2009，29（3）：521-526.

[6]Werner D，Newton W E. Nitrogen fixation in agriculture forestry[M]. Netherlands：Springer，2005：255-276.

[8]陳紹銘，鄭福壽. 水生生物學實驗法[M]. 北京：海洋出版社，1985：80-85.

[9]國家環境保護總局. 水和廢水監測分析方法[M]. 北京：中國環境科學出版社，2002：258-280.

[10]Hyungseok Y. Nitrogen remove from synthetic wastewater bysimullaneus nitrification and denitrification via nitrite in anintermittently aerated teactor[J]. Wat Res，1999，33（1）：146.

[11]廖雪義，馬光庭，藍榮，等. 亞硝化作用菌種的分離篩選及條件選擇[J]. 安徽農業科學，2007，35（5）：1259-1261.

[12]楊代金，張穗，王玉軍，等. 一株氨氮降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J]. 山東農業科學，2009，3（3）：87-90.endprint

2.2pH值對亞硝化細菌培養的影響

從圖2可知，隨著培養時間的增加，不同pH值下亞硝態氮含量都是先增加后趨于平緩。亞硝化細菌適宜在偏堿性條件下生長，pH偏低時，其活性受到影響，隨著pH值的升高，亞硝化細菌變得活躍。當pH值為8.0時，亞硝態氮濃度最高，為172.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養最佳pH值為8.0，這與廖雪義[11]等的研究結果一致。

2.3Na2CO3濃度對亞硝化細菌培養的影響

亞硝化細菌以無機碳源為唯一碳源，因此培養體系中無機碳源的含量會對亞硝化細菌的生長產生影響。自然界中無機碳主要以CO2、HCO-3、CO2-33種形式存在，不同形式的無機碳源對亞硝化細菌的生長影響有一定影響，原來液體培養基以CaCO3為唯一碳源，由于CaCO3較難溶解，碳源釋放不足，因此補加易溶解的Na2CO3以提供更多的碳源供亞硝化細菌生長所需。

從圖3可知，隨著培養時間的增加，不同濃度Na2CO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當Na2CO3濃度為0.2%時，亞硝態氮濃度最高，為171.44 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌液體培養基中最佳Na2CO3濃度為0.2%。

2.4NH4HCO3濃度對亞硝化細菌培養的影響

以NH+4為氮源最適合亞硝化細菌的生長，即硝化作用效率最高。NH4HCO3不但能提供NH+4形式氮源，且能提供HCO-3形式碳源，有利于亞硝化細菌獲得更多形式的碳源。

從圖4可知，隨著培養時間的增加，不同濃度的NH4HCO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當氮源較少時，無法滿足亞硝化細菌的生長需要，過多則會對亞硝化細菌有一定的刺激，硝化作用反而受到抑制。當NH4HCO3濃度為0.2%時，亞硝態氮濃度最高，為179.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌最佳NH4HCO3濃度為0.2%，這與楊代金等[12]的研究結果相近。

2.5刺激因子LaCl3對亞硝化細菌培養的影響

LaCl3對亞硝化細菌酶的作用與其濃度有關，當濃度較低時對酶具有變構激活作用，而濃度高時對酶具有抑制作用。在一定的LaCl3含量范圍內，亞硝化速率隨LaCl3含量的增加而增大。當LaCl3濃度為0.004%時，亞硝態氮濃度最高，為183.12 mg/L，當LaCl3濃度超過0.004%時，反而對亞硝態氮的積累有抑制作用（圖5）。

在加入0.2%Na2CO3、0.2% NH4HCO3、0.004% LaCl3的液體培養基中培養亞硝化細菌，pH值8.0，30 ℃，110 r/min培養10 d，每1 d測定亞硝態氮、銨態氮、硝態氮的含量，結果見圖6。

從圖6可以看出，在最佳培養條件下，隨著培養時間的增加，亞硝態氮含量逐漸增加，最高達185.36 mg/L，銨態氮去除率達到92.52%，硝態氮含量始終保持在較低水平，說明經過優化培養后，該亞硝化細菌的脫氮性能較好。

2.6培養方式對亞硝化細菌生長的影響

從圖7可以看出，在半連續培養中，隨著培養時間的增加，在三角瓶和量筒中進行半連續培養的亞硝化細菌，其脫氮性能總體呈增加趨勢。在每次更換培養基之前，亞硝態氮含量逐漸增加。第一次更換培養基前的亞硝態氮最高含量分別為86.04 mg/L和80.11 mg/L，最后一次更換培養基后，亞硝態氮的含量最高，分別達到174.17 mg/L和156.33 mg/L，分別增加了50.60%和48.75%。同時采用三角瓶培養的亞硝化細菌脫氮性能優于量筒培養的。原因可能是：（1）三角瓶底部空間較大，有利于亞硝化細菌生長和營養物質的傳遞，量筒底部狹小，不利于亞硝化細菌大量繁殖，也不利于營養物質順利輸送；（2）由于亞硝化細菌對氧氣需求較低，三角瓶自下而上空間逐漸縮小，阻礙了過多的氧氣進入，從而更有利于亞硝化細菌生長。

從圖8可知，經過連續式培養，亞硝化細菌的亞硝態氮含量總體呈增加的趨勢，最大值達到202.56 mg/L，40 d時亞硝態氮含量為178.08 mg/L，略高于半連續培養的亞硝態氮含量（174.17 mg/L），但連續式培養較半連續式培養操作更方便，同時能夠較好地有利于亞硝化細菌菌群數量的增長和繁殖，可為今后亞硝化細菌實驗室的擴大化培養提供參考。

3結論

本試驗優化后的亞硝化細菌液體培養條件為0.2%NH4HCO3，0.2%Na2CO3，pH值8.0，溫度30 ℃，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在最佳培養條件下，亞硝化細菌富集亞硝態氮能力最高，可達185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%。連續式培養較半連續式培養能更有利于亞硝化細菌菌群數量的增長和繁殖，且更方便。

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[8]陳紹銘，鄭福壽. 水生生物學實驗法[M]. 北京：海洋出版社，1985：80-85.

[9]國家環境保護總局. 水和廢水監測分析方法[M]. 北京：中國環境科學出版社，2002：258-280.

[10]Hyungseok Y. Nitrogen remove from synthetic wastewater bysimullaneus nitrification and denitrification via nitrite in anintermittently aerated teactor[J]. Wat Res，1999，33（1）：146.

[11]廖雪義，馬光庭，藍榮，等. 亞硝化作用菌種的分離篩選及條件選擇[J]. 安徽農業科學，2007，35（5）：1259-1261.

[12]楊代金，張穗，王玉軍，等. 一株氨氮降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J]. 山東農業科學，2009，3（3）：87-90.endprint

2.2pH值對亞硝化細菌培養的影響

從圖2可知，隨著培養時間的增加，不同pH值下亞硝態氮含量都是先增加后趨于平緩。亞硝化細菌適宜在偏堿性條件下生長，pH偏低時，其活性受到影響，隨著pH值的升高，亞硝化細菌變得活躍。當pH值為8.0時，亞硝態氮濃度最高，為172.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養最佳pH值為8.0，這與廖雪義[11]等的研究結果一致。

2.3Na2CO3濃度對亞硝化細菌培養的影響

亞硝化細菌以無機碳源為唯一碳源，因此培養體系中無機碳源的含量會對亞硝化細菌的生長產生影響。自然界中無機碳主要以CO2、HCO-3、CO2-33種形式存在，不同形式的無機碳源對亞硝化細菌的生長影響有一定影響，原來液體培養基以CaCO3為唯一碳源，由于CaCO3較難溶解，碳源釋放不足，因此補加易溶解的Na2CO3以提供更多的碳源供亞硝化細菌生長所需。

從圖3可知，隨著培養時間的增加，不同濃度Na2CO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當Na2CO3濃度為0.2%時，亞硝態氮濃度最高，為171.44 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌液體培養基中最佳Na2CO3濃度為0.2%。

2.4NH4HCO3濃度對亞硝化細菌培養的影響

以NH+4為氮源最適合亞硝化細菌的生長，即硝化作用效率最高。NH4HCO3不但能提供NH+4形式氮源，且能提供HCO-3形式碳源，有利于亞硝化細菌獲得更多形式的碳源。

從圖4可知，隨著培養時間的增加，不同濃度的NH4HCO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當氮源較少時，無法滿足亞硝化細菌的生長需要，過多則會對亞硝化細菌有一定的刺激，硝化作用反而受到抑制。當NH4HCO3濃度為0.2%時，亞硝態氮濃度最高，為179.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌最佳NH4HCO3濃度為0.2%，這與楊代金等[12]的研究結果相近。

2.5刺激因子LaCl3對亞硝化細菌培養的影響

LaCl3對亞硝化細菌酶的作用與其濃度有關，當濃度較低時對酶具有變構激活作用，而濃度高時對酶具有抑制作用。在一定的LaCl3含量范圍內，亞硝化速率隨LaCl3含量的增加而增大。當LaCl3濃度為0.004%時，亞硝態氮濃度最高，為183.12 mg/L，當LaCl3濃度超過0.004%時，反而對亞硝態氮的積累有抑制作用（圖5）。

在加入0.2%Na2CO3、0.2% NH4HCO3、0.004% LaCl3的液體培養基中培養亞硝化細菌，pH值8.0，30 ℃，110 r/min培養10 d，每1 d測定亞硝態氮、銨態氮、硝態氮的含量，結果見圖6。

從圖6可以看出，在最佳培養條件下，隨著培養時間的增加，亞硝態氮含量逐漸增加，最高達185.36 mg/L，銨態氮去除率達到92.52%，硝態氮含量始終保持在較低水平，說明經過優化培養后，該亞硝化細菌的脫氮性能較好。

2.6培養方式對亞硝化細菌生長的影響

從圖7可以看出，在半連續培養中，隨著培養時間的增加，在三角瓶和量筒中進行半連續培養的亞硝化細菌，其脫氮性能總體呈增加趨勢。在每次更換培養基之前，亞硝態氮含量逐漸增加。第一次更換培養基前的亞硝態氮最高含量分別為86.04 mg/L和80.11 mg/L，最后一次更換培養基后，亞硝態氮的含量最高，分別達到174.17 mg/L和156.33 mg/L，分別增加了50.60%和48.75%。同時采用三角瓶培養的亞硝化細菌脫氮性能優于量筒培養的。原因可能是：（1）三角瓶底部空間較大，有利于亞硝化細菌生長和營養物質的傳遞，量筒底部狹小，不利于亞硝化細菌大量繁殖，也不利于營養物質順利輸送；（2）由于亞硝化細菌對氧氣需求較低，三角瓶自下而上空間逐漸縮小，阻礙了過多的氧氣進入，從而更有利于亞硝化細菌生長。

從圖8可知，經過連續式培養，亞硝化細菌的亞硝態氮含量總體呈增加的趨勢，最大值達到202.56 mg/L，40 d時亞硝態氮含量為178.08 mg/L，略高于半連續培養的亞硝態氮含量（174.17 mg/L），但連續式培養較半連續式培養操作更方便，同時能夠較好地有利于亞硝化細菌菌群數量的增長和繁殖，可為今后亞硝化細菌實驗室的擴大化培養提供參考。

3結論

本試驗優化后的亞硝化細菌液體培養條件為0.2%NH4HCO3，0.2%Na2CO3，pH值8.0，溫度30 ℃，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在最佳培養條件下，亞硝化細菌富集亞硝態氮能力最高，可達185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%。連續式培養較半連續式培養能更有利于亞硝化細菌菌群數量的增長和繁殖，且更方便。

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