響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件

呂黎等

摘要：在搖瓶培養(yǎng)條件下，采用響應(yīng)面法對(duì)紫云英根瘤菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。以單因素試驗(yàn)確定的蔗糖濃度、酵母膏濃度、初始pH值為自變量，以根瘤菌活菌數(shù)為響應(yīng)值，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理及Design Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸分析，得到紫云英根瘤菌最佳發(fā)酵條件，即蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下，根瘤菌活菌數(shù)為20.533億CFU/mL。通過(guò)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證表明，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下根瘤菌活菌數(shù)實(shí)測(cè)值為20.497億CFU/mL，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.2%，表明模型擬合效果良好。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；紫云英根瘤菌；發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0323-03

收稿日期：2013-08-27

基金項(xiàng)目：湖南省長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃（編號(hào)：K1308090-21）。

作者簡(jiǎn)介：呂黎（1985—），女，河南信陽(yáng)人，碩士，實(shí)習(xí)工程師，從事微生物工程和菌株遺傳改良研究。Tel：（0731）83285950；E-mail：ll-137@163.com。

通信作者：豐來(lái)，碩士，助理工程師，從事微生物工程與酶制劑研究。E-mail：fenglai@taigubio.com。紫云英別稱翹搖、紅花草等，是一種能形成共生固氮體系的豆科植物[1]。在我國(guó)水稻種植區(qū)，紫云英作為稻田綠肥，具有改善土壤理化性狀、平衡土壤生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)土壤有機(jī)碳積累、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)等重要作用[2-3]。此外，紫云英還具有較高的食用、飼用價(jià)值。美國(guó)、日本、韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家正在大力發(fā)展紫云英產(chǎn)業(yè)[4]。近年來(lái)隨著耕地質(zhì)量下降，肥料利用率降低，土壤、水源污染嚴(yán)重，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，紫云英種植在我國(guó)逐漸引起重視[5]。與大豆、花生等豆科植物一樣，種植紫云英時(shí)須要根瘤菌形成共生固氮體系，以促進(jìn)生產(chǎn)和保證產(chǎn)量。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌可顯著提高紫云英結(jié)瘤率，提高紫云英總苗數(shù)、株高、單株分枝數(shù)、單株鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)，使其產(chǎn)量增加11%～17%，效果顯著[6-7]。在初次種植紫云英的土壤中接種有效根瘤菌是決定其產(chǎn)量的重要因素，在多年連作地區(qū)接種優(yōu)良菌株也能促進(jìn)增產(chǎn)[8]。目前，市場(chǎng)上紫云英根瘤菌菌劑產(chǎn)品類型和有效活菌數(shù)少，不能有效滿足當(dāng)前紫云英產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究采用響應(yīng)曲面法對(duì)紫云英根瘤菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳發(fā)酵組合，以期為紫云英根瘤菌菌劑的高密度、大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株紫云英根瘤菌（Rhizobium astragali）菌株ACCC 13004。

1.1.2培養(yǎng)基YMA液體培養(yǎng)基：10 g/L甘露醇、3 g/L酵母膏、0.5 g/L K2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.1 g/L NaCl、 0.2 g/L CaSO4、4 mL/L Rh 微量元素液（5 g/L H3BO3，5 g/L NaMnO4），余量為水，pH值 6.8～7.0。YMA斜面培養(yǎng)基：YMA液體培養(yǎng)基加入1.8%瓊脂。

1.1.3主要儀器和設(shè)備1102C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司），SW-CJ-1G型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司），LRH-150型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器公司），LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器廠），Labnet P3960移液槍（美國(guó)萊伯特公司），YP-B10002型電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司），PHS-25型pH計(jì)（上海盛磁儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1種子液培養(yǎng)斜面菌種28 ℃活化24 h后，取2環(huán)接入裝有200 mL YMA液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h后，按照5%接種量接入單因素試驗(yàn)及 Box-Behnken 試驗(yàn)培養(yǎng)基中。

1.2.2活菌數(shù)測(cè)定方法采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。

1.2.3單因素分析法

1.2.3.1碳源濃度對(duì)活菌數(shù)的影響陳海榮等研究發(fā)現(xiàn)，紫云英根瘤菌在甘露醇、蔗糖中生長(zhǎng)較好[8]，但因甘露醇生產(chǎn)成本較高，所以選定蔗糖作為碳源。試驗(yàn)條件為0.9%酵母膏、0.05% K2HPO4、0.02% MgSO4·7H2O、0.01% NaCl、002% CaSO4、4 mL/L Rh 微量元素液，初始pH值 7.0，蔗糖濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，28 ℃搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定活菌數(shù)以確定最佳蔗糖濃度。

1.2.3.2氮源濃度對(duì)活菌數(shù)的影響確定最佳蔗糖濃度后，將酵母膏濃度分別設(shè)為0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%，培養(yǎng)基其他組分不變，初始pH值 7.0，28 ℃搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定活菌數(shù)以確定最佳酵母膏濃度。

1.2.3.3初始pH值對(duì)活菌數(shù)的影響將碳源、氮源設(shè)定為上述試驗(yàn)確定的最佳濃度，培養(yǎng)基其他組分不變，將初始pH值分別設(shè)為 6.5、7、7.5、8、8.5，28 ℃搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定活菌數(shù)以確定最佳初始pH值。

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件根據(jù) Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，將單因素試驗(yàn)確定的最佳蔗糖濃度、酵母膏濃度、初始pH值作為自變量，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)紫云英根瘤菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1最佳蔗糖濃度的確定由圖1可知，當(dāng)蔗糖濃度較低時(shí)，紫云英根瘤菌活菌數(shù)隨著蔗糖濃度的增大而增加；當(dāng)蔗糖濃度為2%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值；之后，紫云英根瘤菌活菌數(shù)略有下降。因此確定最佳蔗糖濃度為2%。

2.1.2最佳酵母膏濃度的確定由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，紫云英活菌數(shù)隨著酵母膏濃度增大而增加，當(dāng)酵母膏濃度為0.9%、1.3%時(shí)活菌數(shù)較高，但兩者差異較小，考慮到生產(chǎn)成本問(wèn)題，所以確定最佳酵母膏濃度為0.9%。

2.1.3最佳初始pH值的確定微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中機(jī)體內(nèi)的絕大多數(shù)反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)需要一個(gè)最適初始pH值范圍，在該范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長(zhǎng)速率最大[9]。由圖3可知，隨著初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為70時(shí)，活菌數(shù)最大，所以確定最佳初始pH值為7.0。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件

2.2.1Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定中心點(diǎn)為蔗糖濃度2%、酵母膏濃度0.9%、pH值7.0。表1是響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件試驗(yàn)的因素及水平，表2是試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果。采用Design-Expert 8軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸方程預(yù)測(cè)及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

3結(jié)論與討論

許多學(xué)者開(kāi)展了關(guān)于根瘤菌培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等經(jīng)濟(jì)作物上，而有關(guān)紫云英根瘤菌發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。紫云英根瘤菌的常用培養(yǎng)基是YMA培養(yǎng)基，由于YMA培養(yǎng)基是半合成培養(yǎng)基，在被用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)成本較高[11]。本研究從降低發(fā)酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏為主要原料優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物生長(zhǎng)受多種外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)條件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生長(zhǎng)需要最多的營(yíng)養(yǎng)成分。在微生物發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，提供適量碳源、氮源，既能達(dá)到生長(zhǎng)量，又不造成資源浪費(fèi)。pH值是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素之一，發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，對(duì)初始pH值的控制尤為重要。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)確定碳源（蔗糖）濃度、氮源（酵母膏）濃度、初始pH值后，進(jìn)一步采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法是一種尋找多因子系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確研究各因子之間的關(guān)系，從而獲得最優(yōu)工藝參數(shù)[12]。本研究借助Design Expert 8軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，在紫云英根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中取得良好的效果，并獲得二次回歸模型，得到最佳培養(yǎng)基為：蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下根瘤菌活菌數(shù)為20.533億CFU/mL。通過(guò)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證表明，該模型合理可靠，能夠較好地預(yù)測(cè)紫云英根瘤菌實(shí)際發(fā)酵情況，為紫云英根瘤菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳堅(jiān)，張輝，朱炳耀，等. 紫云英SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及在品種鑒別中的應(yīng)用[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（9）：1592-1596.

[2]沈生元，莫美英，趙洪祥，等. 氮磷肥單施和配施對(duì)紫云英產(chǎn)量及耕地質(zhì)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：131-132.

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[9]曾曉希，周洪波，柳建設(shè)，等. 脫硅細(xì)菌B.mucilaginosus Lv1-2的培養(yǎng)條件研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，6（9）：5-7.

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[12]Vadde K K，Syrotiuk V R，Montgomery D C. Optimizing protocol interaction using response surface methodology[J]. IEEE Transations on Mobile Computing，2006，5（6）：627-639.

2.1.3最佳初始pH值的確定微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中機(jī)體內(nèi)的絕大多數(shù)反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)需要一個(gè)最適初始pH值范圍，在該范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長(zhǎng)速率最大[9]。由圖3可知，隨著初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為70時(shí)，活菌數(shù)最大，所以確定最佳初始pH值為7.0。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件

2.2.1Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定中心點(diǎn)為蔗糖濃度2%、酵母膏濃度0.9%、pH值7.0。表1是響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件試驗(yàn)的因素及水平，表2是試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果。采用Design-Expert 8軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸方程預(yù)測(cè)及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

3結(jié)論與討論

許多學(xué)者開(kāi)展了關(guān)于根瘤菌培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等經(jīng)濟(jì)作物上，而有關(guān)紫云英根瘤菌發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。紫云英根瘤菌的常用培養(yǎng)基是YMA培養(yǎng)基，由于YMA培養(yǎng)基是半合成培養(yǎng)基，在被用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)成本較高[11]。本研究從降低發(fā)酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏為主要原料優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物生長(zhǎng)受多種外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)條件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生長(zhǎng)需要最多的營(yíng)養(yǎng)成分。在微生物發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，提供適量碳源、氮源，既能達(dá)到生長(zhǎng)量，又不造成資源浪費(fèi)。pH值是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素之一，發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，對(duì)初始pH值的控制尤為重要。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)確定碳源（蔗糖）濃度、氮源（酵母膏）濃度、初始pH值后，進(jìn)一步采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法是一種尋找多因子系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確研究各因子之間的關(guān)系，從而獲得最優(yōu)工藝參數(shù)[12]。本研究借助Design Expert 8軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，在紫云英根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中取得良好的效果，并獲得二次回歸模型，得到最佳培養(yǎng)基為：蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下根瘤菌活菌數(shù)為20.533億CFU/mL。通過(guò)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證表明，該模型合理可靠，能夠較好地預(yù)測(cè)紫云英根瘤菌實(shí)際發(fā)酵情況，為紫云英根瘤菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

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[8]陳海榮，郭照輝，劉前剛，等. 紫云英根瘤菌培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（1）：13-15.

[9]曾曉希，周洪波，柳建設(shè)，等. 脫硅細(xì)菌B.mucilaginosus Lv1-2的培養(yǎng)條件研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，6（9）：5-7.

[10]遲玉成，F(xiàn)an T Q，樊堂群，等. 慢生型花生根瘤菌培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J]. 花生學(xué)報(bào)，2007，36（4）：25-28.

[11]劉保平，周俊初. 根瘤菌菌劑研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，45（1）：57-61.

[12]Vadde K K，Syrotiuk V R，Montgomery D C. Optimizing protocol interaction using response surface methodology[J]. IEEE Transations on Mobile Computing，2006，5（6）：627-639.

2.1.3最佳初始pH值的確定微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中機(jī)體內(nèi)的絕大多數(shù)反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)需要一個(gè)最適初始pH值范圍，在該范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長(zhǎng)速率最大[9]。由圖3可知，隨著初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為70時(shí)，活菌數(shù)最大，所以確定最佳初始pH值為7.0。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件

2.2.1Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定中心點(diǎn)為蔗糖濃度2%、酵母膏濃度0.9%、pH值7.0。表1是響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵條件試驗(yàn)的因素及水平，表2是試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果。采用Design-Expert 8軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸方程預(yù)測(cè)及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

3結(jié)論與討論

許多學(xué)者開(kāi)展了關(guān)于根瘤菌培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等經(jīng)濟(jì)作物上，而有關(guān)紫云英根瘤菌發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。紫云英根瘤菌的常用培養(yǎng)基是YMA培養(yǎng)基，由于YMA培養(yǎng)基是半合成培養(yǎng)基，在被用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)成本較高[11]。本研究從降低發(fā)酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏為主要原料優(yōu)化紫云英根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物生長(zhǎng)受多種外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)條件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生長(zhǎng)需要最多的營(yíng)養(yǎng)成分。在微生物發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，提供適量碳源、氮源，既能達(dá)到生長(zhǎng)量，又不造成資源浪費(fèi)。pH值是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素之一，發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，對(duì)初始pH值的控制尤為重要。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)確定碳源（蔗糖）濃度、氮源（酵母膏）濃度、初始pH值后，進(jìn)一步采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法是一種尋找多因子系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確研究各因子之間的關(guān)系，從而獲得最優(yōu)工藝參數(shù)[12]。本研究借助Design Expert 8軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，在紫云英根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中取得良好的效果，并獲得二次回歸模型，得到最佳培養(yǎng)基為：蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下根瘤菌活菌數(shù)為20.533億CFU/mL。通過(guò)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證表明，該模型合理可靠，能夠較好地預(yù)測(cè)紫云英根瘤菌實(shí)際發(fā)酵情況，為紫云英根瘤菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

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