一種引起脊尾白蝦紅體病病原菌的初步研究

張文文，王庚申，施 慧，謝建軍，許文軍

（1.浙江海洋學院海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316100；2.浙江海洋學院水產學院，浙江舟山 316022）

脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda又名白蝦，其肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，深受群眾喜愛。同時由于其具有生長快、繁殖力強，繁殖周期短，適應性廣，食性雜，經濟價值高等特點，已成為浙江省重要的海水圍塘養殖混養品種。但隨著脊尾白蝦養殖面積的增加，病害也越來越多，給養民造成的損失也越來越嚴重[1]。

2012年7月，浙江省普陀區浙江省海洋水產研究所西閃試驗場暫養脊尾白蝦種蝦爆發紅體病，病蝦緩游于水面或靜伏于池邊，該病傳播快,死亡率高，一周內發病死亡率達到30%左右（最高日死亡率達0.5%）。試驗材料為瀕死紅體病脊尾白蝦，通過病原分離、人工感染試驗、病原菌形態、生理生化特征、16S rDNA和熱激蛋白HSP60基因序列同源性分析以及藥物敏感性試驗等方法，對此次引起脊尾白蝦紅體病的病原進行初步研究，以期為該病的有效防治提供理論依據。現將研究結果報道如下。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料來源

病蝦樣品于2012年7月取自浙江舟山普陀區西閃試驗場的發病池塘，均為表現典型患病癥狀的瀕死個體，體重 0.51±0.02 g。

營養瓊脂、TCBS培養基購自杭州微生物試劑有限公司；API 20NE細菌鑒定系統試劑條是法國生物梅里埃中國有限公司產品；藥敏紙片是杭州天和微生物試劑有限公司產品。TSA培養基系法國Becton公司產品。

Taq酶購自上海生物工程技術有限公司，pGEM—T Easy載體是Promega公司產品。

1.2 病毒 PCR 檢測

取癥狀典型的患病脊尾白蝦分別制備檢測用DNA模板和RNA模板，分別進行對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）和桃拉綜合癥病毒（TSV）PCR檢測。WSSV采用KIMURA[2]NEST-PCR引物，外引物：P1：5’ATCATGGCTGCTTCACAGAC 3’和 P2：5’GGCTGGAGAGGACAAGACAT 3’內引物：P3：5’TCTTCATCAGATGCTACTGC 3’和 P4：5’TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3’；TSV 采用 OIE 手冊（2009 版）[3]推薦的引物，9195：5’TCAATGGAGCTTGGTCC 3’和 9992：5’AAGTAGACAGCCGCGCTT 3’。

1.3 細菌分離

取癥狀典型的患病脊尾白蝦，用70%酒精棉球對其體表擦洗消毒，無菌條件下取心血淋巴液和肝胰腺，在營養瓊脂和TCBS培養基平板上劃線接種；27℃恒溫倒置培養24 h，挑取形態特征一致的優勢菌落進行分離純化；在營養瓊脂和TCBS培養基上接種純化后的優勢菌，27℃恒溫倒置培養24 h，觀察菌落顏色及形態特征。將純化后的菌株置于含15%甘油的液體培養基中，-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.4 人工感染試驗

1.4.1 感染用菌的準備

將實驗菌株接種新鮮營養瓊脂斜面，27℃下恒溫培養（18～24 h），用無菌生理鹽水洗下菌苔，采用分光光度法（OD550 nm）結合活菌平板計數法，制成濃度為106～108個/mL的菌懸液備用。

1.4.2 人工感染試驗用蝦

采自本所試驗場圍塘養殖的健康脊尾白蝦，體重約0.41±0.07 g，選體表無損傷，體色正常的健康蝦作為試驗用蝦。健康蝦在室內暫養3 d，無異常反應后備用。

1.4.3 感染試驗

采用肌肉注射法，對健康脊尾白蝦的第2和第3腹節之間的肌肉進行注射，試驗每組設20尾，每尾注射50 μL菌液，分別為106～108個/mL的菌懸液（根據條件試驗后設定），對照組注射等量無菌生理鹽水。感染試驗在20 cm×50 cm玻璃缸水槽內進行，試驗期間水溫控制在26～27.5℃，每天投喂南美白對蝦配合飼料，每日天換水并觀察其活動、攝食及死亡情況。對患病瀕死的脊尾白蝦取肌肉進行細菌再分離，試驗持續7 d。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態觀察及生理生化試驗

將病原菌稀釋后涂布于TCBS瓊脂平板上，于27℃培養24 h，觀察其菌落形態特征。革蘭氏染色光學顯微鏡觀察。同時用法國生物梅里埃公司API 20NE細菌鑒定系統進行生化反應測試，并根據文獻[4]的方法選取有代表性的生化反應，用細菌微量生化鑒定管補充生化試驗。

1.5.2 16 S rDNA 和 HSP60 基因序列分析

細菌DNA模板的制備：用細菌接種棒挑取純化的單菌落于100 μL無菌去離子水中，沸水煮5 min，冰浴5 min，4℃8 000 r/min離心10 min，取上清作為PCR反應所用模板。

PCR擴增和測序：細菌16S rDNA基因通用引物為27F：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’和1492R：5’TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’；HSP60 基因 PCR 擴增簡并引物 H60F：5’-GGNGAYGGNACNACNACNGCNACNGT-3’，和 H60R：5’TCNCCRAANCCNGGNGCYTTNACNGC3’。PCR 采用 50 μL 反應體系，反應參數：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，40個循環；72℃ 10 min。PCR產物由英濰捷基（上海）貿易有限公司完成測序。用DNASTAR軟件處理測序得到的16S rDNA和HSP60基因序列，并將序列在GenBank核酸數據中進行進行BLAST分析。HSP60基因序列的系統關系分析使用MEGA(version3.1)分析軟件，進行1 000次抽樣自展，鄰位相連法(Neighbor-joining)構建分子系統樹。

1.6 病原菌藥敏試驗

采用紙片擴散法，涂布接種病原菌于營養瓊脂培養基平板，將藥敏紙片用無菌鑷子輕輕貼在平板表面，27℃恒溫培養24 h，觀察抑菌圈的有無與直徑大小，依據藥敏標準判斷菌株對藥物的敏感性。

2 結果

2.1 患病對蝦臨床癥狀

患病脊尾白蝦主要表現為蝦體全身性發紅，額劍發黑，反應遲鈍，攝食減少或不攝食，肝胰臟腫大，腸胃空。

圖1 患病脊尾白蝦Fig.1 The diseased E.carinicauda

2.2 病毒 PCR 檢測

對患病蝦進行WSSV和TSV PCR擴增，結果顯示均為陰性。

圖2 脊尾白蝦WSSV的PCR檢測結果Fig.2 Deteced the WSSV infection of E.carinicauda by PCR

圖3 脊尾白蝦TSV的RT-PCR檢測結果Fig3.Deteced the TSV infection of E.carinicauda by RT-PCR

2.3 病原菌的分離

從患病脊尾白蝦血淋巴和肝胰腺上分離到優勢菌一株，命名為XS1207005。將優勢菌在營養瓊脂和TCBS培養基上純化培養，結果均生長良好。在營養瓊脂培養基上菌落形態、顏色均一致，菌落邊緣規則，光滑、濕潤、不透明、乳白色菌落；在TCBS平板上呈黃色菌落，隆起，圓形，邊緣整齊。經革蘭氏染色鑒定，XS1207005為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下可觀察到菌體呈短桿狀，分散排列，可運動。培養試驗表明，菌株XS1207005在15～30℃生長快，4℃和42℃不生長。

2.4 人工感染試驗結果

采用分光光度法（OD550 nm）結合活菌平板計數法，配制成濃度為 3.4×108、3.4×107、3.4×106CFU/mL的菌懸液。

感染試驗的結果表明，以XS1207005對健康脊尾白蝦進行攻毒感染后，在攻毒第1天即開始陸續死亡，7 d后均全部死亡。死亡對蝦表現出的紅體癥狀與患病對蝦相同；而對照組只有1尾對蝦死亡，且該蝦是因為脫殼時被其它對蝦捕食導致死亡(表1)。

表1 菌株XS1207005對脊尾白蝦攻毒試驗Tab.1 Virulence to E.carinicauda with strain XS1207005

2.5 病原菌的生理生化特征鑒定結果

對菌株XS1207005進行了主要理化特性的測定，詳見表2。結果表明，菌株XS1207005為革蘭氏陰性，油鏡下觀察菌體呈弧形短桿狀，可運動，大小約 1.4 μm×0.8 μm，兼性厭氧、發酵葡萄糖發酵、氧化酶和接觸酶反應均呈陽性、對弧菌抑制劑O/129(2，4-二氨基-6，7-二異丙基喋啶磷酸鹽，150 μg/mL)敏感等，符合弧菌屬的典型特征，征初步判定XS1207005菌株為弧菌屬(Vibrio)細菌。

表2 菌株XS1207005的生理生化結果Tab.2 Physiological and biochemical results of strain XS1207005

2.6 基因序列分析和系統發育樹的構建

測序結果顯示菌株XS1207005的16S rDNA基因序列長度為1 516 bp。將該序列進行BLAST分析，結果顯示：菌株XS1207005與哈維氏弧菌V.harveyi最為接近，同源性高達99%，但16S rDNA基因序列結果顯示，菌株XS1207005與溶藻弧菌V.alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus的同源性也很高，最高達到98%。

試驗同時測定了菌株XS1207005的部分HSP60基因序列，序列長度為496 bp。BLAST分析顯示，該基因序列與弧菌屬細菌的HSP60基因序列的同源性較高（94%～100%）。其中，與哈維氏弧菌的HSP60序列同源性高達99.6%，而與其他弧菌屬細菌的HSP60基因同源性均小于91%。以菌株XS1207005的HSP60序列與相關種屬細菌的HSP60序列構建系統發育樹（圖2），結果表明，菌株XS1207005與哈維氏弧菌自然聚為一支，置信度為100%。

圖4 菌株 XS1207005的16S rDNA(a)和HSP60(b)基因PCR擴增產物Fig.4 PCR amplified products of 16S rDNA gene(a)and HSP60 gene(b)of strain XS1207005

2.7 藥敏試驗結果

采用紙片法測定菌株XS1207005對22種抗菌藥物的敏感性。結果表明，病原菌對先鋒噻肟、復方新諾明、利福平、先鋒必、菌必治、氟哌酸、復方欣及氧氟沙星等8種藥物敏感；對先鋒V、青霉素G、萬古霉素、氨芐青霉素、苯青唑霉素等5種藥物不敏感，對頭孢拉定、紅霉素、呋喃妥因、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、頭孢呋肟等7種藥物中度敏感，詳見表3。

圖5 基于HSP60序列的弧菌系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Vibrio based on HSP60 genes

表3 菌株XS1207005對不同抗菌藥物的敏感性Tab.3 Sensibility of strain XS1207005 to different antibacterial agents

3 討論

“紅體病”是蝦類養殖當中一種危害較大的常見疾病，其主要表現為病蝦蝦體發紅。但正如其他以癥狀命名的疾病一樣，“紅體”只是對蝦發生某些疾病后的一種表觀現象，事實上，研究發現能引起蝦類體色發紅的原因很多。周永燦等[5]曾報道溶藻弧菌和副溶血弧菌可以引起南美白對蝦紅體病；薛輝等[6]報道嗜水氣單胞菌是引起日本沼蝦紅體病的病原，葉雪平等[7]也報道了擬態弧菌是引起青蝦紅體綜合癥病原。根據南美白對蝦的“紅體病”的研究發現[8-11]，病毒、細菌和氨氮過高引起的環境突變均會引起對蝦出現紅體癥狀。本研究從患紅體病的脊尾白蝦中分離到一株優勢菌株XS1207005，根據其菌落形態、生理生化特征及16S rDNA和HSP60基因同源性分析結果，該菌與哈維氏弧菌相似，其中HSP60基因與哈維氏弧菌相應片段同源性高達99.6%，將其鑒定為哈維氏弧菌。用該菌人工感染健康脊尾白蝦，其能使健康蝦發病，且表現出與自然感染病蝦相似的癥狀，因此，可以確定哈維氏弧菌為引起此次暫養脊尾白蝦紅體病的病原。

哈維氏弧菌在海水中是較常見的優勢菌群，廣泛分布于世界各地海水及河口處，并且數量眾多，是海水類弧菌之首，為海洋中正常菌群之一，在多種海洋動物中均存在。哈維氏弧菌是魚、蝦、貝等海水養殖品種的條件性致病菌，研究認為宿主的生理狀態、養殖環境的理化條件均與哈維氏弧菌的致病性密切相關[12]。本次發病的脊尾白蝦是從圍塘捕獲后暫養于室內水泥池，養殖密度變大，同時養殖管理也相應發生了變化，養殖環境發生的這些變化因素使脊尾白蝦造產生了應激反應。在應激期間，脊尾白蝦的自身免疫力會急劇下降，此時對蝦就會極易因感染水體中的條件性致病菌而發病。

在對蝦養殖中，改善水質、定期消毒水體、在餌料中添加Vc和免疫多糖等免疫增強劑以及消毒后投放有益微生物制劑等方法，可以有效預防這類由條件致病菌引起疾病。抗菌藥物的使用是治療該類疾病常用的手段。藥敏結果顯示：從發病蝦上分離到的病原菌對復方新諾明、氧氟沙星、氟派酸等高度敏感，本試驗以口服藥餌結合水體消毒的方法進行治療，取得了明顯的療效。

紅體病也是近年脊尾白蝦養殖過程當中重要的一種疾病，但目前還無有關脊尾白蝦“紅體病”病原的研究報道，而哈維氏弧菌引起蝦類紅體病的報道也尚屬首次，有關蝦體發紅的機理，有待于進一步研究。

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