HPLC-ELSD法測定硫酸慶大霉素含量的方法改進

陳志 李傳響

HPLC-ELSD法測定硫酸慶大霉素含量的方法改進

陳志 李傳響

目的建立HPLC-ELSD面積歸一化法測定硫酸慶大霉素含量的測定方法。方法色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm/5 μm)；流動相：0.2 mol/L的乙酸-甲醇(93：7)；流速0.6 ml/min；柱溫：30℃；蒸發光散射檢測器Alltech 3300的飄移管溫度為110℃；氣體流速為2.6 L/min。結果硫酸慶大霉素各組分分離完全, 用面積歸一化法測定慶大霉素的含量。結論方法簡便快速, 準確度高,重現性好, 可有效控制藥品質量

HPLC-EISD法；慶大霉素；面積歸一化；含量

慶大霉素是氨基糖苷類廣譜抗生素, 臨床應用很廣, 但是由于慶大霉素分子結構中不存在共軛體系, 不具備紫外吸收特性且成分復雜, 故其含量測定方法中國藥典規定采用抗生素微生物檢定法中的二劑量法測定, 該方法不但操作繁瑣復雜, 對操作人員熟練技能要求高, 重現性差。有文獻報道過采用衍生化法［1］、氧化還原法［2］測定其含量, 也有采用HPLC-ELSD方法［3］測定慶大霉素組分。為此作者參考有關文獻資料［4-6］在現在有的HPLC-ELSD檢測方法的基礎上進一步優化慶大霉素含量測定的方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀, (包括CDM-20A控制器, SIL-20A自動進樣器, CTO-20AC柱溫箱), Alltech 3300型蒸發光檢測器。島津Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm)色譜柱。慶大霉素標準品(130326-201015 630 U/mg, C1 27.1%；C1a 25.3%;C2 30.1%;C2a 17.4%);硫酸慶大霉素注射液(A廠家：13020218；1111201；1112251； B廠家：13030516；12071211；11092201)甲醇(色譜純)乙酸(分析純)。

2 方法

2.1色譜條件 色譜柱Insetsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm/5 μm)流動相：0.2 mol/L的乙酸-甲醇(93：7)；流速0.6 ml/ min；柱溫：30℃；蒸發光散射檢測器Alltech 3300的飄移管溫度為110℃；氣體流速為2.6 L/min。進樣量20 μl。

2.2溶液的制備 精密稱取小諾霉素標準適量, 加水溶解并稀釋成每1 ml中含0.2、0.5、1.0 mg的溶液作為小諾霉素標準品溶液。精密稱取慶大霉素標準品適量, 加水溶解并稀釋成每1 ml中含0.2、0.5、1.5 mg的慶大霉素標準品對照液。取硫酸慶大霉素注射液適量, 加水稀釋成每1 ml含硫酸慶大霉素2.5 mg的溶液, 作為供試品溶液。

2.3系統性試驗 分別取慶大霉素和小諾霉素標準品各適量, 加水溶解并稀釋成每1 ml含慶大霉素1.0 mg與小諾霉素0.2 mg的混合溶液, 取20 μl注入色譜儀, 照2.1的色譜條件測定, 記錄圖譜, 出峰順序從第二個主峰開始計, 依次為：西索米星, 慶大霉素C1a, C2, 小諾霉素, C2a, C1；小諾霉素和C2, C2a之間的分離度應符合要求, 小諾霉素峰面積的相對標準差應<2.0%。見圖1。

2.4方法學驗證 專屬性驗證：取2.2項下的溶液照2.1項的色譜條件進樣記錄色譜圖。

重復性驗證：取硫酸慶大霉素標準品溶液照2.1項下的色譜條件測定6次, 以面積歸一化法計算各組分的含量。

2.5樣品含量的測定 取2.2項下制備的供試品溶液, 照2.1項的色譜條件進行測定, 并記錄色譜圖, 直接進行峰面積歸一化法(硫酸峰除外)計算慶大霉素各組分的總含量。同時與抗生素微生物檢定法做對比。

3 結果

3.1專屬性驗證結果 結果顯示, 慶大霉素的各個組分與小諾霉素的分離度都能達到要求, 達到基線分離。見圖1。

3.2重復性驗證結果 結果顯示, 慶大霉素的組分C1a、C2、C2a、C1的含量RSD分別為：0.6%、0.5%、0.7%、0.7%(n=6)。

3.3樣品含量測定結果 結果見圖2, 表1。

圖1 硫酸慶大霉素各組分與小諾霉素分離度

表1 硫酸慶大霉素樣品含量測定對比表(%)

3 討論

3.1溶劑與流動相選擇, 硫酸慶大霉素、西索米星、小諾霉素都是易溶于水的物質, 且在實驗中發現水與流動相對慶大霉素含量測定沒有差別, 故選擇水為溶劑。文獻資料在測定慶大霉素C組分時, 采用的流動相是0.2 mol/L的三氟乙酸-甲醇, 而作者在經過大量比對試驗后發現, 采用0.2 mol/L的乙酸-甲醇(93:7)為流動相, 也能達很好的分離效果, 而且還可以降低三氟乙酸帶來的實驗室毒性, 降低實驗成本, 故本文選用0.2 mol/L乙酸-甲醇(93:7)為流動相。

3.2由于慶大霉素是由微生物發酵提取而得, 組分多而復雜, 其中慶大霉素主要以4個組分為主, 發酵液中的其他組分如西索米星、小諾霉素與慶大霉素有大致相同的抗菌譜。只是不同廠家的生產發酵提純工藝不同, 會導致慶大霉素的主要組分含量也不一致。而微生物法是通過抑菌能力而評判其效價含量, 其中也包括小諾霉素、西索米星的抑菌作用,在用微生物法測定時, 慶大霉素供試品可能與慶大霉素標準品的抑菌效果不盡相同, 也就可以間接解釋, 用二劑量法測定慶大霉素含量時, 效價偏低, 差異較大現象。而面積歸一化法相比對數線性回歸法、微生物法［3］, 不僅可以避免計算復雜, 操作繁瑣, 還可以更準確快速地通過測定慶大霉素4個組分的所占的比例, 更好地控制慶大霉素的產品質量, 快速簡便地監控和改進生產發酵提純工藝。

圖2 硫酸慶大霉素樣品的測定

3.3采用本文描述的面積歸一化法測定硫酸慶大霉素含量時, 關鍵在于系統性試驗要達到基線分離的要求, 因此, 試劑選擇、條件設置以衣流動相比例應配制準確。

［1］ 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典.2000版二部.北京:化學工業出版社, 2000:866.

［2］ British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia 2007.London:The stationary Office , 2007:753.

［3］ 中華人民共和國藥典委員委會.中國藥典.2010年版二部.中國醫藥科技出版社, 2010:976.

［4］ 張建革, 劉英, 王立萍.HPLC-ELSD測定硫酸慶大霉素注射液含量及其有關物質的研究.華西藥學雜志, 2010, 25(1):80-82.

［5］ 熊雯, 袁濤.HPLC-ELSD測定硫酸慶大霉素有關物質及其C組分質量標準的改進.中國抗生素雜志, 2011, 36(10):775-777.

［6］ 高燕霞, 姜建國, 張西如.高效液相色譜-蒸發光散射檢測法測定硫酸慶大霉素注射劑中有關物質.中國藥業, 2010, 19(6):20-21.

Improvement of determination of gentamicin sulfate content by HPLC-ELSD

CHEN Zhi, LI Chuanxiang.Anqing Medical College, Anqing 246001, China

Objective To establish a method for the determination of gentamicin sulfate content by HPLCELSD method.MethodsA C18 column was used, the mobile was 0.2mol/L Acetic Acid-methanol(93:7), the flow was 0.6ml/min the detecter was ELSD .The temperature of drift was 110℃ and flow rate of carrier gas was 2.6 L/min.RusltsThe gentamicin sulfate was sperated from its related substance completely.The Norm of peak area technique could be used to determine the gentamicin sulfate.ConclusionThe method is simple and convenient, accurate, sensible an reproducible.This method is suitable for the quality control of the gentamicin sulfate.

HPLC-EISD method; Gentamicin; Normalized peak area technique; Content

246001 安慶醫藥高等?？茖W校(陳志)；安慶市食品藥品檢驗所(李傳響)