鮮牛乳中摻雜非蛋白氮及非乳蛋白的檢測研究

李美桃，王波，葛冬梅

(徐州市產品質量監督檢驗中心，江蘇 徐州 221000)

0 引 言

我國現行乳品標準中測定蛋白質質量濃度以凱氏定氮法為主[1]。凱氏定氮法實際上是測定總氮量的一種方法，只有在被測物的組成是蛋白質時才能用此方法來估算蛋白質質量濃度。然而在實際測定過程中，被測物的組成是否為蛋白質是很難判定的，所以當被測物里加入一些含氮量高的物質時，會使被測物的蛋白質含量大大“提高”[2-6]。三聚氰胺事件就是一個很好的例證。2008年發布的GB/T 21704-2008《乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定》標準可以測定樣品中非蛋白氮的質量濃度[7]，但不能判定蛋白質來源。本課題利用氨基酸分析儀對鮮牛乳中的游離氨基酸及水解氨基酸進行分析，以確定牛乳中氨基酸質量濃度及比例組成，選出1種或多種氨基酸作為特征氨基酸，結合凱氏定氮法測定鮮牛乳中的粗蛋白質量濃度，用以辨別鮮牛乳中的蛋白質來源。

1 材料與方法

1.1 樣品

本次實驗未攙假牛乳樣品由江蘇徐州綠健乳品有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

日立L-8900氨基酸分析儀、自動凱氏定氮系統(FOSS2800)，濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸等均為分析純

1.3 方法

1.3.1 牛乳中蛋白質的測定

GB 5009.5-2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[1]

1.3.2 鮮牛乳中氨基酸的測定[8-14]

(1)牛乳水解氨基酸試樣制備。準確吸取2 mL牛乳樣品于玻璃水解管中，加入2 mL濃鹽酸，將水解管與真空泵連接抽真空，酒精噴燈封口，110℃水解22～24 h，待水解管冷卻后開管，將溶液轉入圓底燒瓶中，使用旋轉蒸發儀將樣品蒸干，除去濃鹽酸，用濃度為0.02 mol/L的鹽酸稀釋定容，最后經孔徑為0.45 μm的濾膜過濾后上機待測。

(2)牛乳游離氨基酸試樣制備。吸取適量牛乳，用0.02 N的鹽酸稀釋定容，經孔徑為0.45 μm的濾膜過濾后待測。

(3)牛乳氨基酸的分析。使用氨基酸自動分析儀對上述樣品處理液進行分析。

儀器分析條件：4.6 mm×60 mm，填料為3 μm磺酸型陽離子樹脂分離柱；緩沖液流速0.4 mL/min，反應液流速0.35 mL/min，柱溫57℃，標準樣品濃度2 nmol/20 μL，每個樣品分析時間40 min。

表1 鮮乳中游離氨基酸的組成 g/100L

2 結果與分析

2.1 鮮牛乳和水解動植物蛋白中游離氨基酸的分析

對鮮牛乳中的游離氨基酸進行分析，結果如表1所示。鮮牛乳中的游離氨基酸總量為0.10～0.25 g/L，質量濃度較低，其中谷氨酸質量濃度最高，其次為丙氨酸、精氨酸和賴氨酸。由表1可以看出，鮮牛乳中游離氨基酸總量以及各種氨基酸質量濃度雖有所差別，但各氨基酸之間的比例以及各氨基酸占總氨基酸的比例是比較固定的，基本在一個比較小的范圍內浮動，天門冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸占總氨基酸的質量分數均超過了5%，但賴氨酸和組氨酸在不同樣品中質量濃度差別較明顯，說明這兩種氨基酸質量濃度不是非常穩定或者在測定過程中受其他因素影響較大，因此這兩種氨基酸不適合做特征氨基酸。另外，甘氨酸、賴氨酸和蛋氨酸有可能出現外源加入的情況，因此這3種氨基酸也不適合作為特征氨基酸。谷氨酸質量濃度較高，且穩定性較好，可以作為特征氨基酸的首選。由表1可知，5種不同鮮牛乳樣品中甘氨酸/谷氨酸分別為0.092，0.088，0.091，0.089，0.088，這個比值還是比較穩定的。

水解植物蛋白(HVP)和水解動物蛋白(HAP)中的游離氨基酸的測定結果如表2所示。

由表2可以看出，蛋白水解液中游離氨基酸的質量濃度較高，達到120.6 g/L以上，遠遠高于牛乳中游離氨基酸的質量濃度，是牛乳中游離氨基酸的500倍左右，因此如果在生牛乳中加入蛋白水解液，其中游離氨基酸的質量濃度將大幅度的提高，因此可以通過檢測鮮牛乳中游離氨基酸的質量濃度來鑒別，鮮乳中是否添加了蛋白水解液。蛋白水解液中各類氨基酸的質量濃度高低與鮮牛乳存在一定的差異，蛋白水解液中質量濃度較高為谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸，而牛乳中游離氨基酸中以谷氨酸最多,其次為丙氨酸、精氨酸和賴氨酸，二者在游離氨基酸的組成上差異較大，因此可以從游離氨基酸的質量濃度和組成上來分析是否添加了蛋白水解液等游離氨基酸高的非乳蛋白成分。

表2 水解動植物蛋白中各種氨基酸質量濃度 g/L

2.2 鮮牛乳中蛋白質和水解氨基酸的分析

氨基酸是構成真蛋白的單位，利用鹽酸水解的方法，將鮮牛乳中的真蛋白水解，通過水解后各種氨基酸的質量濃度確定水解蛋白即真蛋白的質量濃度，同時與凱氏定氮法測定的粗蛋白質量濃度對比，獲得各鮮牛乳中真蛋白占總蛋白的質量分數，如表3所示。

表3 鮮牛乳樣品中粗蛋白和水解蛋白含量

由表3可知，利用凱氏定氮法測得的鮮牛乳總蛋白質質量濃度在3.0～3.5 g/100 mL之間，滿足國家相關標準鮮牛乳中蛋白質質量濃度在2.9～3.5 g/100 mL之間的要求，同時發現通過鹽酸水解獲得各鮮牛乳樣品的水解氨基酸總量與總蛋白質質量濃度相差不大，占粗蛋白質量分數的95%以上，這不僅說明了鮮牛乳中幾乎所有含氮化合物均為乳蛋白，也說明了鹽酸水解較徹底，可以得到相對理想的蛋白質水解產物。

鮮牛乳樣品通過鹽酸水解和氨基酸自動分析儀分析獲得的譜圖如圖1所示。

利用鹽酸水解并通過氨基酸分析儀分析可以準確測定鮮牛乳中真蛋白質量分數，同時與凱式定氮法測定的蛋白質質量分數相比較，利用酸水解蛋白占粗蛋白的質量分數初步判斷鮮牛乳中是否添加類似三聚氰胺的假蛋白[15]。

通過圖1的鮮牛乳水解氨基酸分析譜圖可以看出，17種氨基酸的分離效果較好，說明此法可以較準確地獲得各種水解氨基酸質量濃度。利用氨基酸自動分析儀對鹽酸水解后5個鮮牛乳樣品進行測定分析，分析數據見參考文獻[15]，發現鮮牛乳水解后的17種氨基酸中，谷氨酸的質量分數最高，占總量的22%左右，質量分數在5%～10%的氨基酸包括：天冬氨酸、絲氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和脯氨酸，半胱氨酸檢測出的質量分數最低，僅有1.9%左右，這有可能是鮮牛乳中的本身含量低，但也可能是酸水解時，部分半胱氨酸被破壞，因此在選擇特征性氨基酸時，盡量不予以考慮。綜合氨基酸的質量分數和穩定性，選擇天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸作為鮮牛乳水解氨基酸的特征性氨基酸。當人為添加非乳蛋白時，通過水解蛋白分析比較，這些特征性氨基酸的質量分數會發生較大變化，由此可以作為判定添加非乳蛋白的依據。

2.3 分析結果的驗證

為驗證分析結果的準確性和可靠性，將同一牛乳分成若干份，分別添加不同質量濃度的三聚氰胺、甘氨酸和蛋白水解液進行測定，測定結果統計如表4所示。

由表4可以看出，當在牛乳中添加不同質量濃度的三聚氰胺時，隨著三聚氰胺質量濃度的加大所測到的蛋白質質量濃度也在逐步提高，而總的氨基酸質量濃度卻基本保持不變。當添加20 mg/L的三聚氰胺時，氨基酸總量與蛋白質質量分數的比值還保持在95%以上，當三聚氰胺添加量增大到50 mg/L時，該比值已經降低到94.2%；當三聚氰胺添加量增大到500 mg/L時，該比值已經降低到87.5%，已經比較明顯的發生了變化。對于三聚氰胺來講，當添加量達到50 mg/L時，我們通過氨基酸總量與粗蛋白質的比值就可以準確判斷出是否添加了非蛋白氮。

表4 鮮乳中添加不同物質檢測結果統計結果

當蛋白水解液的質量濃度逐步加大時，游離氨基酸總量迅速上升，但甘氨酸和谷氨酸的比值變化幅度不是太大，處在一個相對穩定的范圍之內。因此，當游離氨基酸質量濃度升高而其他氨基酸質量濃度相對穩定時，基本上可以斷定出該樣品中添加了蛋白水解液類的物質。

當鮮乳中游離氨基酸質量濃度和水解氨基酸總量均正常的情況下，則以某種氨基酸和谷氨酸之比來進行判定。鮮乳中甘氨酸和谷氨酸之比正常應不高于0.1，超出該范圍則有可能加入甘氨酸。同樣，賴氨酸、蛋氨酸與谷氨酸之比一般不應高于0.45和0.2。由表4可以看出，甘氨酸的添加量由20 mg/L逐步增加到500 mg/L時，甘氨酸的質量濃度明顯增加，同時甘氨酸和谷氨酸的比值也明顯變大，由0.11增大到1.54。由此可見，即使添加了很少量的甘氨酸(＜100 mg/L)，雖然游離氨基酸總量沒有超過250 mg/L的上限，但是甘氨酸與谷氨酸的比值已經大于0.1，此時仍可以根據比值判斷出添加了甘氨酸。

3 結 論

(1)以水解氨基酸總量作為真蛋白含量，真蛋白/粗蛋白應該在95%以上。低于95%時，可能有非蛋白氮(比如三聚氰胺、尿素等)加入；

(2)鮮乳中游離氨基酸質量濃度應低于25 g/100 L，當游離氨基酸總量大于25 g/100 L時，則可能有水解蛋白(如皮革水解物、毛發水解物等)或單體氨基酸(如甘氨酸)加入；當某種氨基酸質量濃度高于25 g/100 L，且其他氨基酸含量正常時，則可能有單體氨基酸加入；

本研究暫未對其他蛋白(例如：大豆蛋白)進行分析，因此暫時無法辨別添加到牛乳中的其他蛋白，但根據研究結果，可以將天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸作為乳品水解氨基酸的特征性氨基酸，以便進行下一步的研究。另外，本研究所采集的鮮牛乳均來自徐州地區，因為奶牛品種、生長環境及喂飼方式等因素影響，可能存在區域性差異。

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