龍膽苦苷生物合成途徑研究進展

王彩云等

摘要：龍膽苦苷屬裂環烯醚萜類化合物，是傳統中藥龍膽的主要有效成分，具有抗炎、保肝、利膽、健胃、抗腫瘤等藥理活性，其生物合成途徑可分為異戊烯基焦磷酸合成、裂環番木鱉酸生物合成和龍膽苦苷生物合成3個階段，受脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶、脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構酶、細胞色素P450等多種酶的調控。本文綜述了近年龍膽苦苷生物合成及其調控機制的研究現狀，旨在為龍膽苦苷生物合成及其調控機制的進一步研究提供參考。

關鍵詞：龍膽苦苷；生物合成；MVA；MEP；轉錄因子

中圖分類號：R284.3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）03-0004-06

龍膽苦苷（gentiopicroside）廣泛存在于龍膽科植物中，是滇龍膽（Gentiana rigescens）等藥用植物中一類重要的次生代謝產物[1]，也是龍膽瀉肝丸等180多種中藥產品的主要藥效成分。現代藥理學研究證實，龍膽苦苷具有保肝、利膽、鎮痛、抗炎、抗菌、健胃、抗腫瘤以及誘發神經軸突生長等作用[2-5]。目前，龍膽苦苷主要從滇龍膽、秦艽（Gentiana macrophylla）等野生植物中提取，但隨著龍膽苦苷需求量的劇增，野生藥用植物不能完全滿足市場需求[6]。因此，對龍膽苦苷生物合成途徑進行研究，利用基因工程、代謝工程等手段生產龍膽苦苷勢在必行，明確龍膽苦苷的生物合成途徑及其調控機制是利用生物技術手段生產龍膽苦苷的前提。

近年來，龍膽苦苷因其獨特的藥用價值以及在臨床上的廣泛應用[7]，受到國內外學者的廣泛關注，并在龍膽苦苷的提取、含量測定、含量影響因素、藥代動力學[8]、生物轉化[9]和結構修飾等方面取得了大量科研成果。本文從目前已知的單萜生物合成途徑出發，以近年的研究成果為依據，歸納出龍膽苦苷的基本合成途徑，綜述了龍膽苦苷的理化性質、生物合成途徑以及該途徑中關鍵酶的研究現狀，以期為龍膽苦苷的開發和利用提供參考。

1 龍膽苦苷的理化性質

龍膽苦苷分子式為C16H20O9，分子量為356.3246，化學名為5-ethenyl-6-（β-D-glucopyranosyloxy）-5，6-dihydro-1H，3H-pyrano[3，4-O]pyran-1-one。龍膽苦苷純品為白色粉末或淡黃（紅）色針狀結晶，有內酯苷類化合物的顏色反應，其表觀油水分配系數理論值為-1.41，23 ℃下的表觀油水分配系數為lgP=-1.21[10]，表明龍膽苦苷的親水性較強，脂溶性較差，易溶解于水、甲醇及乙醇等溶劑。龍膽苦苷在龍膽科植物中普遍存在，于1854年首次從龍膽科植物黃龍膽（Gentiana lutea）中分離得到[11]；1961年，Canonica等初步獲得龍膽苦苷的化學結構[12]；1968年，Inouye等最終確定了龍膽苦苷的化學結構（圖1）[13]。

2 龍膽苦苷生物合成途徑

龍膽苦苷屬于單萜類化合物，其生物合成途徑主要分為3個階段：（1）通過甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑和2-甲基-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑合成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）；（2） IPP經過不同的酶促反應合成裂環番木鱉酸；（3） 裂環番木鱉酸依次經過獐牙菜苷、獐牙菜苦苷，最終形成龍膽苦苷。

Coscia等于1967年用14C標記Swertia caroliniensis的甲羥戊酸，發現龍膽苦苷中出現14C，表明龍膽苦苷起始于甲羥戊酸途徑[14]。據筆者所在課題組前期對滇龍膽三年生根、莖轉錄組測序研究發現，龍膽苦苷生物合成調控基因在MEP途徑中上調，表明龍膽苦苷生物合成主要來源于MEP途徑，部分來源于MVA途徑。龍膽苦苷生物合成的第一階段與一般的單萜類化合物在萜類基本骨架合成階段完全相同，即首先在細胞質中通過MVA途徑或者在質體中通過MEP途徑合成萜類前體物質IPP，然后轉化為GPP[15]。MVA途徑自被人類發現至今已有半個世紀，其生物合成途徑比較清楚，該途徑首先由3分子的乙酰-CoA在乙酰乙酰輔酶A硫解酶和乙酰乙酰輔酶A合酶作用下縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA），縮合產物在其還原酶（HMGA）的催化作用下被還原成MVA，再經過脫羧和磷酸化反應生成GPP[16]。MEP途徑是在脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）的縮合作用下，由1分子3-磷酸甘油醛和1分子丙酮酸生成1分子的1-脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP），并在其還原異構酶的催化作用下轉化為2-甲基-赤蘚醇-4-磷酸（MEP），MEP再依次經過2-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉移酶、4-二磷酸胞苷-2-甲基赤蘚糖激酶、2-甲基-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶、1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸合酶催化生成1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP），接著由異戊烯基焦磷酸激酶催化 HMBPP 生成IPP，IPP和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）之間的轉換由IPP異構酶（IDI）來完成[17]。

龍膽苦苷生物合成第二階段，即裂環番木鱉酸生物合成階段，以GPP為前體，脫磷酸形成香葉醇。從香葉醇到裂環番木鱉酸的合成大約需要11個酶促步驟，目前只有5個被鑒定，即P450依賴性香葉醇10-羥化酶（G10H）、無環單萜伯醇脫氫酶（ADH）、單萜環化酶（MC）、S-腺苷-L-蛋氨酸：馬錢苷酸甲基轉移酶（LAMT）和P450依賴性裂環番木鱉酸合成酶（SLS）[18]。該階段IPP和DMAPP在GPPS的催化作用下生成GPP，GPP合成后需要進行復雜的開環、環化和糖基化步驟，即GPP經香葉醇合成酶催化合成香葉醇，香葉醇C-2位置在細胞色素P450還原酶和香葉醇10-羥化酶的催化作用下生成10-脫氧香葉醇，這是裂環番木鱉酸生物合成的最重要的步驟。10-脫氧香葉醇被10-羥基香葉醇氧化還原酶（10HGO）氧化，在NAPDH氧化還原酶存在時，生成10-氧香葉醛，接著在單萜環化酶的催化下形成琉蟻二醛（iridodial），經縮醛反應形成iridotial，經過不斷反應形成7-脫氧番木鱉酸（deoxyloganic acid），在7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶作用下生成馬錢苷酸，在S-腺苷-L-蛋氨酸：馬錢苷酸甲基轉移酶的催化作用下生成番木鱉酸，SLS催化番木鱉酸形成裂環番木鱉酸（secologanin）[18-19]。Coscia等發現牻牛兒基焦磷酸能并入到Swertia caroliniensis的有效成分番木鱉酸，進一步證明了GPP是龍膽苦苷生物合成的中間物[20]。1969年，Coscia等證明番木鱉酸是龍膽苦苷生物合成的前體[21]，這一結論同時也由Inouye和Grger這2個課題組分別在三花龍膽和長柄獐牙菜（Swertia petiolata）中得到證實。

在龍膽苦苷生物合成的最后一個階段，裂環番木鱉酸經過不斷的衍化生成獐牙菜苷（sweroside）、獐牙菜苦苷（swertiamarin），最終脫羥基形成龍膽苦苷[22]。Inouye等于1967年通過前體飼養試驗證明在三花龍膽（Gentiana triflora）中甲羥戊酸內酯被并入到龍膽苦苷中；同時也出現在日本獐牙菜（Swertia japonica）的獐牙菜苷和獐牙菜苦苷中，獐牙菜苷中 14C 的含量約是獐牙菜苦苷含量的6倍，表明獐牙菜苷是獐牙菜苦苷的前體[14]。Tan等經過試驗證明裂環番木鱉酸是龍膽苦苷等裂環烯醚萜類化合物的關鍵中間物[23]。隨后，Inouye 等采用同位素示蹤獐牙菜苷，并證明它是龍膽草（Gentiana scabra）中龍膽苦苷生物合成的一個中間物[24]。Jensen 等研究表明，在龍膽科植物中普遍存在著獐牙菜苷到獐牙菜苦苷再到龍膽苦苷的生物轉化[22]。

目前，主要采用同位素示蹤法，通過產物來反推其生物合成途徑，并加以驗證，是完善環烯醚萜類化合物次生代謝合成的一般策略。目前，龍膽苦苷的完整合成途徑并不完全清楚，其基本的反應步驟如圖2所示。

3 龍膽苦苷生物合成途徑中的關鍵酶

隨著龍膽苦苷需求量的劇增，其生物合成途徑中的關鍵酶也備受關注。在龍膽苦苷的生物合成途徑中，IPP合成階段的大部分酶基因已被廣泛克隆和研究；第二階段（即裂環番木鱉酸生物合成階段）只克隆到6個基因，其余5個基因還有待進一步研究；第三階段從獐牙菜苷到獐牙菜苦苷再到龍膽苦苷的衍化機制并不清楚。

3.1 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase，HMGR）催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）轉化為MVA，這是一個不可逆過程，故HMGR被認為是MVA途徑中的第一個限速步驟；HMGR在類異戊二烯的生物合成中起重要作用，也是細胞質萜類代謝中的重要調控位點[26]。植物中HMGR組成一個多基因家族，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中HMGR酶由HMG1和HMG2基因編碼[27]；馬鈴薯（Solanum tuberosum）中含有3個HMGR基因；番茄（Solanum lycopersicum）中含有4個HMGR基因；而在動物中僅發現1個HMGR基因。目前該基因已在杜仲橡膠（Eucommia ulmoides）[28]等植物和李斯特菌（Listeria monocytogenes）[29]等細菌中被克隆和研究。

3.2 脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶

脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS），催化MEP途徑第一步反應，是MEP途徑的第1個關鍵酶，它能與焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）共同作用，使丙酮酸脫羧后與3-磷酸甘油醛合成1-脫氧木酮糖-5-磷酸（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP）[30]。DXS是MEP途徑中植物萜類物質合成的第一個限速酶，該基因過量表達可促進下游相關萜類化合物的積累。Peebles等在長春花（Catharanthus roseus）萜類吲哚生物堿生物合成的研究中發現，DXS的超表達導致阿嗎堿、洛柯定堿、水甘草堿等產物的大量增加，表明DXS在萜類生物合成中起重要作用[31]。Estévez等對擬南芥突變體clal-1進行研究發現，DXS對植物葉綠體及白色體的發育具有重要作用，主要表現在當突變體缺失DXS基因時呈現“白化”特征，添加脫氧木酮糖后有新的色素生成[32]。目前，已從玉米（Zea mays）[33]、番茄[34]、銀杏（Ginkgo biloba）[35]等植物中獲得DXS基因。近年來，大量研究表明DXS在類異戊二烯的MEP生物合成途徑中起重要作用[36-37]。

3.3 脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構酶

脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）存在于質體中的MEP途徑中，DXP通過DXR催化，以NADPH為還原劑，依賴二價陽離子，經原子重排和還原生成MEP，從而把DXP引入MEP途徑[38]。DXR是MEP途徑中的第2個限速酶，也是細胞質體中類異戊二烯化合物代謝的重要調控位點。Carretero等研究

發現，擬南芥中DXR基因的超表達能夠增加MEP衍生質體類異戊二烯（如葉綠素和類胡蘿卜素）的積累，表明DXR在MEP途徑的調控中起重要作用[39]。Xing等對擬南芥dxr突變體進行研究發現，DXR基因的破壞會導致擬南芥突變體植株白化、矮小以及毛狀體起始缺陷和氣孔關閉，表明DXR基因在植物生長發育過程中起重要作用[40]。近年來，DXR在植物生長和發育過程以及MEP途徑中的重要作用引起人們的廣泛關注。目前，DXR基因已在細菌、藻類、植物、原生動物中發現，但在人體中并未發現。

3.4 2-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉移酶

2-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉移酶（2-C-methylerythritol-4-phosphate cytidyltransferase，MECT）屬于胞嘧啶轉移酶家族的一個成員，參與MEP途徑的第三步酶促反應，將二磷酸胞苷（CDP）和MEP連接生成4-二磷酸胞苷-2-甲基-赤蘚醇（CDP-ME），該反應依賴于胞苷三磷酸（CTP）[30]。目前，已從擬南芥、銀杏等植物中發現該基因，但對其編碼酶的相關功能研究并未見報道。為了驗證MECT在萜類生物合成中的作用，Rohdich等用14C標記MECT，結果發現生成帶有14C標記的CDP-ME；將大腸埃希菌（Escherichia coli）MECT基因轉入辣椒，發現CDP-ME在質體中參與類胡蘿卜素的生物合成，表明MECT與次生代謝產物合成有關[41]。

3.5 2-甲基-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶

2-甲基-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶（2-C-methylerythritol-2，4-cyclodiphosphate synthase，MECPS）是MEP途徑上的第5個酶，催化CDP-MEP生成2-甲基-赤蘚醇-2，4-環二磷酸（ME-cPP）。目前，Buetow等已在結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）中證實MECPS具有潛在的藥物功能測定作用，可作為治療靶點[42]。Burlat等經Northern雜交和原位雜交發現MECPS與MEP途徑中DXS、DXR基因以及下游途徑中的香葉醇10-羥化酶（G10H）基因類似，顯示出相同的細胞特異表達模式，表明MECPS在次生代謝產物的生物合成中起重要作用[43]。

3.6 異戊烯基轉移酶

異戊烯基轉移酶（prenyltransferase，PTs）催化IPP縮合成非環式的GPP，這是萜類合成中的重要過程。該基因已在紫草（Lithospermum erythrorhizon）[44]、苦參（Sophora flavescens）[45]、白羽扇豆（Lupinus albus）[46]等植物中被廣泛研究。近年來，Nickerson等研究發現PTs與膽固醇的代謝有關[47]；Akhtar等經研究證實了番茄中順式異戊烯基轉移酶（cis-prenyltransferase，CPTs）與長鏈多聚類異戊二烯的合成有關，含有至少5個異戊二烯單位[48]。

3.7 牻牛兒基焦磷酸合成酶

牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranyl pyrophosphate synthase，GPPS）是異戊二烯途徑中一個很重要的酶，目前對GPPS的研究主要集中在其對單萜和倍半萜的影響[49]。GPPS催化IPP形成GPP，是植物單萜生物合成中的一個關鍵酶，在吸引傳粉者和次生代謝產物的防御中起重要作用[50]。GPPS在多種植物中被分離，但有關其調控機制的研究很少。Martin等對葡萄（Vitis vinifera）中VvGPPS的轉錄進行分析，表明VvGPPS基因在單萜生物合成中起重要作用[51]。Chang等研究發現歐薄荷（Mentha piperita）中的MpGPPS包含2個具有催化功能的大亞基和2個非催化的具有調控功能的小亞基，并且證實與薄荷醇的生物合成有關[52]。

3.8 香葉醇合成酶

香葉醇合成酶（geraniol synthase，GES）是單萜芳香化合物香葉醇產生過程中的關鍵酶。Yoko等的18O同位素示蹤試驗研究結果表明GES催化牻牛兒基焦磷酸生成香葉醇，幾乎專一性地在羅勒腺體中產生，在同型二聚體蛋白中存在活性，且需要Mn2+作為二價金屬輔因子來激活[53]。Marc等研究結果表明酵母菌株erg20K197G中GES在YNB（酵母氮源基質）中的表達導致大量單萜化合物（香葉醇、沉香醇、香茅醇、橙花醇）的生物合成，且GES的表達導致香葉醇產量高出16倍；推斷出GPP的不穩定導致GES特異性損失，不會導致香葉醇單萜合成酶功能的損失，但會使其失活[54]。目前，已在羅勒、紫蘇、長春花中克隆到相關基因。羅勒GES可以用于評估單萜在不同植物中的異源表達譜。Marc等用根癌農桿菌轉化葡萄，用浸花法轉化擬南芥，農桿菌滲透瞬時表達煙草葉片均獲得羅勒GES轉基因植株，并在葉片中檢測到高含量的香葉醇；另外，在大腸桿菌轉化株培養基中檢測到香葉醇[55]。

3.9 細胞色素P450還原酶

細胞色素P450還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）是真核生物的一個膜結合黃素蛋白，是細胞色素P450單加氧酶的催化反應所必須的，因為它在電子傳遞中的功能是從NADPH到細胞色素P450蛋白。許多P450蛋白與香葉醇到裂環番木鱉酸的生物合成有關，包括香葉醇10-羥化酶、7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶和裂環番木鱉酸合成酶[56]。Shen等通過RT-qPCR研究發現，細胞色素P450單加氧酶（cyp71av1）在轉基因黃花蒿植株轉錄水平上具有較高的表達量；HPLC分析顯示在cyp71av1和細胞色素P450還原酶（cpr）的過表達植株中，青蒿素的含量明顯增加，表明cyp71av1、cpr基因的過表達增加了黃花蒿（Artemisia annua）中青蒿素的含量[57]。細胞色素P450單加氧酶與內源性化合物的生物合成和外源性物質的分解代謝有關，他們的活性依賴于細胞色素P450還原酶。

3.10 細胞色素P450

細胞色素P450形成植物蛋白的最大家族，參與生物堿、萜類、類苯基丙烷等代謝產物的產生。P450蛋白基因在植物基因組中的數量占總注釋基因的1%，表明植物中的大量反應依賴于各種P450[58]。在植物次生代謝過程中，P450催化羥基化反應和單加氧反應，另外還涉及到一些非常規反應，如甲二氧基-橋形成和石碳酸偶聯反應等[59]。Chang等研究發現細胞色素P450參與龍膽苦苷的分解代謝[7]；在龍膽苦苷生物合成途徑中，許多反應都是通過細胞色素P450蛋白進行催化的；單萜和倍半萜的基本碳氫骨架形成后，經P450加氧酶催化而發生羥化反應[60]。Sung等研究發現在龍膽苦苷生物合成中，香葉醇-10-羥化酶（Geraniol 10-hydroxylase，G10H）是一個極其重要的酶，它是CYP76B6家族中的一個細胞色素P450單加氧酶，在C-10位置羥化單萜香葉醇產生10-羥化香葉醇，是單萜和吲哚生物堿生物合成過程中裂環番木鱉酸產生的重要調控酶，也是不同植物中環烯醚萜類形成的第一個關鍵酶[61]。Wang等從川西獐牙菜（Swertia mussotii）中克隆到香葉醇10-羥化酶基因，并證實它具有香葉醇羥化的催化活性[62]。

3.11 7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶

Katano等研究表明7-脫氧番木鱉酸7-羥化酶（7-deoxyloganin 7-hydroxylase，DL7H）能催化7-脫氧番木鱉酸轉化為番木鱉酸，具有7-脫氧番木鱉酸的底物特異性，在金銀花（Lonicera japonica）細胞懸浮培養物的微粒體中檢測到其活性依賴于NADPH和分子氧，該酶學反應能被一氧化碳和許多細胞色素P450抑制劑（尤其是酮康唑）抑制，表明該反應能被細胞色素P450介導[63]。

3.12 裂環番木鱉酸合成酶

裂環番木鱉酸合成酶（secologanin synthase，SLS）在番木鱉酸形成裂環番木鱉酸的過程中催化環戊烷的氧化還原反應，屬于細胞色素P450家族中CYP72A1亞家族成員，在長春花單萜生物合成中被鑒定[64-65]。Yamamoto等首次從金銀花的細胞懸浮培養微粒體中檢測到SLS[66]。SLS在反應中的作用依賴于NADPH和分子氧，能被一氧化碳和細胞色素P450抑制劑阻斷，表明該反應受細胞色素P450調節。

4 展望

龍膽苦苷的生物合成途徑是一個受多基因調控的、非常復雜的動態變化過程。隨著分子生物學和代謝組學的發展，龍膽苦苷生物合成途徑的基本框架和相關酶的研究已取得了一定的進展，但還有許多細節步驟不清楚，其生物合成途徑仍有許多問題亟待解決。（1）香葉醇是裂環番木鱉酸生物合成的關鍵中間物，但香葉醇到裂環番木鱉酸之間的具體酶促反應至今還不清楚。在龍膽苦苷生物合成過程中，從裂環番木鱉酸到獐牙菜苷、獐牙菜苦苷以及龍膽苦苷之間的反應機制也不清楚，需要通過試驗進一步研究。（2）龍膽苦苷的生物合成中，MVA和MEP途徑中的酶大部分已被系統地研究，環烯醚萜類化合物生物合成過程中的調控酶只有細胞色素P450、G10H、SLS等被廣泛研究，有關單萜環化酶、LAMT等的研究很少，而其他反應過程，如臭蟻二醛到7-脫氧番木鱉酸、獐牙菜苷與獐牙菜苦苷以及龍膽苦苷之間的酶未見報道。（3）代謝產物的生物合成途徑都是由結構基因和調控基因共同調控的，龍膽苦苷生物合成途徑中的部分結構基因和個別調控基因僅在部分植物中被克隆，如WRKY轉錄因子被報道間接參與龍膽苦苷的生物合成過程，但并未對其具體調控機制進行深入研究。目前，龍膽科植物的基因組還未被測序，在今后的研究中，需要通過對龍膽科具有代表性的藥材（如龍膽或秦艽等）進行轉錄組測序，挖掘該途徑中大量的結構基因和調控基因，并對其功能進行研究，進而從分子生物學水平闡明龍膽苦苷生物合成途徑及其調控機制。因而，了解植物中龍膽苦苷的生物合成途徑及其調控機理，并采用基因工程手段來生產龍膽苦苷，對野生龍膽資源的保護和解決市場上龍膽等藥材的供需矛盾都具有重要的理論價值和實踐價值。

參考文獻：

[1]Wang Y M，Xu M，Wang D，et al. Review on “Long-Dan”，one of the traditional Chinese medicinal herbs recorded in Chinese Pharmacopoeia[J]. Nat Prod Bioprospect，2012，2（1）：1-10.

[2]Wang C G，Zhang T，Cui X M，et al. Hepatoprotective effects of a Chinese herbal formula，longyin decoction，on carbon-tetrachloride-induced liver injury in chickens[J]. Evid-Based Compl Alt，2013：1-9.

[3]Wang Y M，Xu M，Wang D，et al. Anti-inflammatory compounds of “Qin-Jiao”，the roots of Gentiana dahurica（Gentianaceae）[J]. J Ethnopharmacol，2013，147（2）：341-348.

[4]Jia L Y，Guo H Y，Jia B Z，et al. Anti-tumour activities and a high-performance liquid chromatography mass spectrometric method for analysis of the constituents of Lomatogonium carinthiacum[J]. Nat Prod Res，2011，25（2）：100-107.

[5]Chiba K，Yamazaki M，Kikuchi M，et al. New physiological function of secoiridoids：neuritogenic activity in PC12h cells[J]. J Nat Med，2011，65（1）：186-190.

[6]李智敏，劉 莉，李晚誼，等. 滇龍膽的藥用資源研究與開發進展[J]. 云南大學學報：自然科學版，2009，31（增刊）：485-487.

[7]Chang-Liao W L，Chien C F，Lin L C，et al. Isolation of gentiopicroside from Gentianae Radix and its pharmacokinetics on liver ischemia/reperfusion rats[J]. J Ethnopharmacol，2012，141（2）：668-673.

[8]Liu S B，Ma L，Guo H J，et al. Gentiopicroside attenuates morphine rewarding effect through downregulation of GluN2B receptors in nucleus accumbens[J]. CNS Neurosci Ther，2012，18（8）：652-658.

[9]Wang C L，Liu J L，Liu Z L，et al. Biomimetic transformation of gentiopicroside to erythrocentaurin[J]. Chinese Chem Lett，2009，20（2）：150-152.

[10]趙文娜，尚平平，孫文基. HPLC法測定龍膽苦苷的表觀油水分配系數[J]. 藥物分析雜志，2009，29（7）：1093-1095.

[11]趙 曄. 桃葉珊瑚苷和龍膽苦苷的熱性能與生物代謝研究[D]. 西安：西北大學，2008.

[12]Canonica L，Pelizzoni F，Manitto P，et al. Structure of gentiopicroside[J]. Tetrahedron，1961，16（1/2/3/4）：192-200.

[13]Inouye H，Yoshida T，Nakamura Y，et al. Die stereochemie einiger secoiridoidglucoside und die revision der struktur des gentiopicrosids[J]. Tetrahedron Lett，1968，9（42）：4429-4432.

[14]Coscia C J，Guarnaccia R. Biosynthesis of gentiopicroside，a novel monoterpene[J]. J Am Chem Soc，1967，89（5）：1280-1281.

[15]石 磊，葛 鋒，劉迪秋，等. 三七總皂苷生物合成與關鍵酶調控的研究進展[J]. 西北植物學報，2010，30（11）：2358-2364.

[16]Chappell J，Wolf F，Proulx J，et al. Is the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants？[J]. Plant Physiol，1995，109（4）：1337-1343.

[17]Seemann M，Sum Bui B T，Wolff M，et al. Isoprenoid biosynthesis in plant chloroplasts via the MEP pathway：direct thylakoid/ferredoxin-dependent photoreduction of GcpE/IspG[J]. FEBS Lett，2006，580（6）：1547-1552.

[18]Suttpanta N. Characterization of G10H promoter and isolation of WRKY transcription factors involved in Catharanthus terpenoid indole alkaloid biosynthesis pathway[D]. Kentucky：University of Kentucky Doctoral Dissertations，2011.

[19]Sun P，Song S H，Zhou L L，et al. Transcriptome analysis reveals putative genes involved in iridoid biosynthesis in Rehmannia glutinosa[J]. Int J Mol Sci，2012，13（10）：13748-13763.

[20]Coscia C J，Guarnaccia R. Natural occurrence and biosynthesis of a cyclopentanoid monoterpene carboxylic acid[J]. Chem Commun，1968（3）：138-140.

[21]Coscia C J，Botta L，Guarnaccia R. On the mechanism of iridoid and secoiridoid monoterpene biosynthesis[J]. Arch Biochem Biophys，1970，136（2）：498-506.

[22]Jensen S R，Schripsema J. Chemotaxonomy and pharmacology of Gentianaceae[M]//Struwe L，Albert V A. Gentianaceae：systematics and natural history. Cambridge：Cambridge University Press，2002：573-631.

[23]Tan R X，Wolfender J L，Zhang L X，et al. Acyl secoiridoids and antifungal constituents from Gentiana macrophylla[J]. Phytochemistry，1996，42（5）：1305-1313.

[24]Inouye H，Nakamura Y. ber die monoterpenglucoside und verwandte naturstoffe-Ⅹ Ⅳ：Die struktur der beiden stark bitter schmeckenden glucoside amarogentin und amaroswerin aus Swertia japonica[J]. Tetrahedron，1971，27（10）：1951-1966.