川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA克隆及生物信息學分析

龍石太等

摘要：參照GenBank已公布的綿羊BMP2基因序列與牛BMP4基因序列分別設計一對引物，以川中黑山羊卵巢總RNA為模板，采用RT-PCR技術擴增川中黑山羊BMP2基因和BMP4基因的cDNA序列并進行克隆、測序及相關生物信息學分析。結果表明，川中黑山羊BMP2基因編碼區全長為1 188 bp（GenBank登錄號為KF492982），BMP4基因編碼區全長為1 230 bp（GenBank登錄號為KF492983），分別編碼395、409個氨基酸。川中黑山羊與綿羊、牛、豬、人、馬、鼠、雞BMP2基因編碼區序列的同源性分別為99.7%、98.7%、92.0%、89.6%、91.4%、86.1%、78.9%；川中黑山羊與綿羊、牛、豬、人、馬、鼠、雞BMP4基因編碼區序列的同源性分別為99.3%、99.1%、95.9%、95.2%、94.4%、920%、80.1%。用MEGA 4.0構建物種間分子系統進化樹，結果顯示，BMP2基因和BMP4基因的聚類反應基本一致，川中黑山羊首先與綿羊聚類，再分別與牛、豬、馬、人和鼠聚類，最后與雞聚類，這與動物分類學基本吻合。

關鍵詞：川中黑山羊；BMP2基因；BMP4基因；克??；生物信息學

中圖分類號：S827.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）03-0019-04

骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉化生長因子β（TGF-β）超家族中最大的亞族，是Urist等于1965年從脫鈣骨基質中分離得到的一種有活性的蛋白質，并利用該蛋白質成功誘導了異位成骨[1]，所以命名為骨形態發生蛋白。許多研究表明，BMPs不僅能誘導骨及軟骨的形成、分化，而且能影響脊椎動物的神經細胞、造血組織、眼睛、腎和上皮附屬器官的形成、器官發生以及組織定型與重塑等[2]。BMPs在動物大部分組織中均有表達，在機體的許多生命活動中發揮作用，所以關于BMPs的研究越來越受到重視。有研究發現，BMPs與雌性動物的繁殖機能相關，通過旁分泌/自分泌調節作用對卵巢進行調節，從而調節卵泡發育[3-4]。也有研究表明，BMP4可以促進小鼠原始卵泡的形成及原始卵泡發育為初級卵泡[5]。BMP2、BMP4、BMP6 和BMP7 蛋白可抑制綿羊顆粒細胞分泌孕酮，但不會影響綿羊顆粒細胞增殖和存活[6]，BMP2蛋白可抑制雌二醇與孕酮的合成及cAMP的釋放[7]，BMP4蛋白可抑制綿羊垂體細胞FSH釋放[8]，由此推測，BMP2與BMP4可能是多羔動物的黃體抑制劑。BMPs還與早期胚胎的細胞凋亡與增殖密切相關，對細胞分化與器官發生、發育具有重要意義，BMP2、BMP4位點的丟失均可導致動物胚胎性死亡[9-10]，是胚胎發育過程中必不可少的信號分子[11-12]。

川中黑山羊是經過長期自然選擇和人工重點培育而成的多胎山羊品種，它具有性成熟早（母羊初情期為3～4月齡，初配年齡為5～6月齡）、產仔率高（平均產羔率為270%）、生長速度快、產肉性能好、耐粗食、抗病力強、適應性良好等優點。為進一步闡明川中黑山羊多胎的分子生物學基礎，本研究克隆了川中黑山羊BMP2、BMP4基因完整編碼區，與 GenBank 已公布的其他物種進行序列比對，并在此基礎上構建物種間分子系統進化樹。到目前為止，有關山羊BMP2與BMP4在生物信息學方面的研究尚未見報道，所以本研究采用生物信息學方法分析這2個基因及其氨基酸序列的理化性質、結構特征等，旨在為進一步開展川中黑山羊BMP2、BMP4基因的結構功能、遺傳變異、表達調控以及繁殖性狀的相關分析等研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在四川省樂至縣天龍科技示范園選取6只3～5歲的健康川中黑山羊，在其發情后12～24 h（發情期中期）屠宰，立即采集卵巢等組織，迅速在室溫下的生理鹽水中沖洗3次，置于盛有RNA later的EP管中，迅速投入到液氮中保存，帶回實驗室保存于超低溫冰箱（-80 ℃）中備用。

1.2 試劑和載體

川中黑山羊組織總RNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、感受態細胞均購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas（MBI）公司，X-Gal、IPTG、氨芐青霉素、克隆載體PMD-19 Vector購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA膠回收試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1.3 卵巢總RNA的提取

用動物組織總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取川中黑山羊卵巢總RNA。

1.4 cDNA第一鏈的合成

用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成。

1.5 引物設計及PCR擴增目的基因

參照綿羊BMP2基因（GenBank登錄號XM_004014353）設計1對引物（F：5′-AGAAGGAAGAGGCGAAGGAAGG-3′，R：5′-TGCTGTGCTAACGACACCCAC-3′），擴增片段全長1 331 bp。參照牛的BMP4基因（GenBank登錄號為NM_001045877）的mRNA序列，用軟件Primer Premier 5設計1對引物（F：5′-ATGATTCCTGGTAACCGAATGC-3′，R：5′-AGGGATGTGGTTGCCGCTGA-3′），擴增片段全長 1 230 bp。引物序列送往上海英俊生物工程有限公司合成。

以合成的卵巢cDNA第一鏈為模板，擴增BMP2、BMP4基因，PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃ 退火40 s（BMP2）/62 ℃退火40 s（BMP4），72 ℃延伸 80 s，35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。產物用 15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，再用凝膠成像系統進行檢測、拍照。

1.6 克隆及重組子篩選和鑒定

PCR產物經電泳檢測后，按DNA膠回收試劑盒說明進行膠回收，回收產物與PMD-19載體連接，置于金屬浴中16 ℃過夜。連接反應產物轉化宿主菌5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體平板上，37 ℃培養過夜。挑選白色單克隆菌落于LB液體培養基中37 ℃振蕩培養12 h，取菌液作PCR進行陽性重組子鑒定，并提取重組質粒。

1.7 生物信息學分析

1.7.1 核酸序列分析 測序完成后獲得上下游序列，利用DNAman軟件進行序列拼接，并根據測序峰圖調整。從NCBI上查找相關物種的BMP2、BMP4基因序列，保存備用。用NCBI在線程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找ORF，確定CDS區，并將CDS區翻譯成氨基酸序列。

1.7.2 蛋白質序列分析 用ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質的一級結構及其理化參數（分子量、等電點、分子式等）；用ProtScal程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析疏水性；用TMHMM Server v2.0程序（http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行跨膜區預測；用SignalP 4.0 Server程序（http：//genome.cbs.D tu.dk/ser-vices/SignalP/）預測信號肽；用PSORT程序（http：//psort.hgc.jp/form.html）預測亞細胞定位；用GOR程序（http：//npsa- pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa automat.pl？ page =npsa_ gor4.html）預測蛋白質二級結構；用Phyre2程序（http：//www.sbg.bio.ic.ac. uk/phyre2/html/page.cgi？id =index）預測蛋白質三級結構。

2 結果與分析

2.1 川中黑山羊總RNA提取

從提取的RNA中取4 μL進行RNA純度和完整性的檢測。用1.5%瓊脂糖凝膠在150 V下電泳15 min，結果如圖1所示。圖1顯示，28S和18S RNA均比較完整，條帶明亮，說明所提取的總RNA是完整的，可用于下一步試驗。

2.2 PCR擴增結果

吸取PCR產物各4 μL，對其進行電泳檢測。用1%瓊脂

糖凝 膠電泳檢測條帶，結果如圖2所示，其中BMP2基因的目的條帶與預期大小1 331 bp基本一致，BMP4基因的目的條帶與預期大小1 230 bp基本一致，且目的條帶明亮，可以進行下一步膠回收試驗。

2.3 川中黑山羊BMP2、BMP4基因CDS區的核苷酸序列及其特征

用DNAman軟件對測序所得序列進行序列比對、拼接，去除載體序列后，得到BMP2基因1 331 bp，BMP4基因 1 230 bp，與預期一致。用NCBI ORF Finder查找其開放性閱讀框，并翻譯出氨基酸序列。將川中黑山羊BMP2、BMP4基因序列提交給GenBank，登錄號分別為KF492982、KF492983。

通過DNAman分析川中黑山羊與其他物種BMP2、BMP4基因CDS區的核苷酸序列同源性，結果顯示，川中黑山羊BMP2基因的CDS區核苷酸序列與綿羊（XM_004014353）、牛（NM_001099141）、豬（NM_001195399）、人（NM_001200）、馬（XM_514508）、鼠（NM_007553）和雞（NM_204358）相應序列間的一致性分別為99.7%、98.7%、92.0%、89.6%、91.4%、86.1%、78.9%；川中黑山羊BMP4基因的CDS區核苷酸序列與綿羊（NM_001110277）、牛（NM_0 01045877）、豬（NM_001101031）、人（NM_130850）、馬（XM_003314330）和鼠（NM_007554）相應序列間的一致性分別為99.3%、99.1%、959%、95.2%、94.4%、92.0%、80.1%。說明在不同物種間這2個基因具有較高的一致性，屬于較保守的基因之一。

利用DNAman、ClustalX、MEGA 4.0對相應物種的BMP2、BMP4基因編碼區進行多序列一致性比對，計算出遺傳距離，并構建基因Neighbor-Joining（NJ）系統發生樹（圖3、圖4）。從圖3、圖4可以看出，川中黑山羊與綿羊親緣關系最近，其次是牛，與雞的親緣關系最遠，這與遺傳距離和核苷酸同源性比對的結果一致。

2.4 川中黑山羊BMP2、BMP4蛋白的結構特征

Prot Param分析結果表明，川中黑山羊BMP2、BMP4蛋白的分子式分別為C1974H3097N581O568S16、C2050H3214N616O598S16，相對分子質量分別為44 569.8、46 570.8，理論等電點PI分別為8.96、8.11，半衰期都為30 h，不穩定參數分別為54.83、5754，二者均屬不穩定蛋白；脂肪系數依次為79.49、80.05，疏水性平均數依次為-0.423、-0.545，預測BMP2、BMP4蛋白均為親水性蛋白。結合ProScale程序分析結果可知，川中黑山羊BMP2蛋白共有9個高親水區，BMP4蛋白有10個高親水區，這是蛋白進化中氨基酸插入的主要位點。而在這2個蛋白的N段都存在明顯的疏水區，可能是信號肽。通過SignalP 3.0服務器進行信號肽預測，結果顯示，在BMP2基因編碼的氨基酸序列第23～24（甘氨酸-亮氨酸）位點可能存在信號肽位點，該多肽N端存在信號肽的概率為0.837；BMP4多肽N端存在信號肽的概率為0.793，信號肽位點可能位于第24位點與第25位點（丙氨酸至絲氨酸）之間，二者屬分泌型蛋白。

通過在線程序TMHMM 2.0進行跨膜區分析，BMP2和BMP4 都只存在1個跨膜區，且跨膜區都位于信號肽位置，結合對信號肽的考慮可知，這2個基因編碼的成熟肽都沒有跨膜區。TargetP亞細胞定位預測結果顯示，BMP2成熟蛋白位于細胞外的概率是0.728，BMP4蛋白位于細胞外的概率是0785。

用GOR程序在線預測BMP2蛋白二級結構，結果顯示，該蛋白包括α螺旋（127個AA殘基）、β折疊（86個AA殘基）、無規卷曲（182個AA殘基）3種模塊，分別占靶蛋白的32.15%、21.77%、46.08%。BMP4蛋白的α螺旋（127個AA殘基）、β折疊（74個AA殘基）、無規卷曲（208個AA殘基）分別占靶蛋白的31.05%、18.09%、50.86%。

通過Phyre 2.0預測BMP2和BMP4的三級結構（圖5和圖6），得到BMP2靶標蛋白，其殘基建模覆蓋率81%（320個氨基酸殘基）；BMP4靶蛋白，其殘基建模覆蓋率為79%（324個氨基酸殘基），置信度達100%，說明靶標蛋白與模板蛋白的空間結構很接近，適合的空間結構比例很大，空間保真性很高，川中黑山羊BMP2和BMP4蛋白多處氨基酸位點具有較高的能量，處于不穩定狀態，說明二者為不穩定蛋白。

3 討論

3.1 序列比對

本研究利用PCR技術從川中黑山羊卵巢組織中克隆得到川中黑山羊BMP2、BMP4基因的cDNA序列，包含了長度為 1 188、1 230 bp的完整編碼區，分別編碼395、409個氨基酸。經同源性比對可知，所得序列與綿羊BMP2、BMP4基因的cDNA序列一致性分別達到99.7%、99.3%，因此可確定克隆所得序列為川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA序列。與其他物種進行核苷酸序列間的同源性比對，結果表明，川中黑山羊的BMP2、BMP4基因編碼區序列與其他物種同源性很高，基因序列較保守，相對而言，BMP4基因的保守性比BMP2基因更強。DNAman比對結果顯示，BMP2基因編碼區存在種屬間特異插入或缺失，人的BMP2基因編碼區長度為 1 191 bp，比川中黑山羊和牛多 3 bp，編碼396個氨基酸；而鼠的BMP2基因編碼區長為1 185 bp，比川中黑山羊和牛少 3 bp，編碼394個氨基酸。不同物種間BMP4基因編碼區也有差異，人和鼠比川中黑山羊和牛少 3 bp。不同組織來源也可能存在蛋白質前體長度的差異，如骨肉瘤表達的BMP4前體蛋白為408個氨基酸，而成熟胎盤組織中表達的BMP4前體蛋白為402個氨基酸[13]。

3.2 分子系統進化關系

川中黑山羊與綿羊、牛、人、鼠、雞等物種間BMP2基因構建的分子系統進化樹結果表明，川中黑山羊首先與綿羊聚為一類，再分別與牛、豬、馬、人、鼠聚類，最后與雞聚類，各分支置信度均在90%以上，聚類結果置信度高。由BMP4基因構建的分子系統進化樹可以看出，川中黑山羊與綿羊、牛始終聚為一支，再依次與豬、人、馬、鼠、雞聚類。牛和綿羊以及豬和人在聚類時置信度分別為73%和78%，導致置信度偏低的原因在于BMP4在聚類物種間核苷酸同源性差異很小，川中黑山羊與綿羊和牛的BMP4基因核苷酸同源性分別為99.3%和99.1%。由此可以看出，BMP2基因更適用于構建物種間分子系統進化樹，該分子系統進化樹較準確、真實地反映了各物種間的進化關系和親緣關系，即親緣關系越近的物種，同源性越高，遺傳距離越小。

3.3 結構與功能

川中黑山羊的BMP4基因位于第14號染色體長臂2區 2～3 帶之間，由5個外顯子、4個內含子組成，其 cDNA 編碼區全長均1 230 bp，編碼 409 個氨基酸，成熟肽為116 個氨基酸殘基[14]。人的BMP2基因定位于第20號染色體短臂1區2帶上，由3個外顯子、2個內含子組成[15]，編碼區全長 1 191 bp，編碼396個氨基酸殘基的多肽，其成熟肽基因為 339 bp，成熟肽包括113個氨基酸分子[16]。分析BMP2、BMP4基因的cDNA序列后發現，成熟肽基因序列均在3′端編碼區內[17]，同源性比對結果也表明，3′端是BMPs的保守區。

BMP2與BMP4作為TGF-β家族的重要成員，且屬于同一亞族，具有分泌型蛋白質的特征，二者氨基酸同源性高達90%，BMP2、BMP4、BMP7是BMPs家族中生物活性最高的3種蛋白[18]。BMPs晶體結構的核心是一個胱氨酸結，從核心向外延伸來自于β鏈和反方向的α螺旋環的2個手指樣凸起，α螺旋環和β鏈則為手指。C端是該家族的保守區，成熟的BMPs有7個半胱氨酸，并且位置絕對保守，其中6個半胱氨酸形成分子內二硫鍵，另一個半胱氨酸形成分子間二硫鍵，借此分子間二硫鍵連接2條多肽形成二聚體結構[19]。與所有TGF-β家族一樣，BMP2、BMP4在蛋白質合成后期氨基端的前肽區會被切除，形成具有活性的成熟肽，二聚體的形成和分子成熟的過程可能發生于細胞內或分泌過程中。因此，只有形成二聚體形式，這些蛋白質才具有生物活性，才能啟動細胞的信號傳導。與石曉衛等對黃淮山羊BMP4的結構與功能的分析結果[14]一致，BMP2與BMP4具有BMPs家族的典型結構特征，這些結構特征構成了它們在骨組織形成、原始卵泡發育及早期胚胎發育中發揮作用的基礎[20]。

近年來，對山羊和綿羊TGF-β超家族的研究逐漸增多，大量研究表明，BMP-IB、BMP15、GDF9是影響山羊與綿羊多胎的主效基因。BMP2與BMP4作為山羊和綿羊繁殖性狀候選基因的報道不多，儲明星等檢測到了小尾寒羊BMP4基因存在多態性，并命名為AA/AB/BB型，BB型純合子個體產羔量比AA 型和AB型個體的平均產羔量多0.6只[21]。徐業芬等對湖羊的BMP2、BMP4、BMP6、BMP7基因的mRNA 表達水平與排卵數關系進行了研究，結果發現，這幾個基因在卵巢組織中均有表達，多羔組的BMP4基因mRNA水平極顯著高于單羔組，BMP4基因的mRNA表達量與湖羊排卵量呈正相關，可作為影響湖羊排卵數的候選基因進一步研究[22]。目前，已在牛、豬、鼠、雞等多種動物卵巢中檢測到BMP2、BMP4的mRNA，通過旁分泌作用控制顆粒細胞的增殖與分化，并作用于卵巢、子宮及調節生殖內分泌系統。因此，開展BMP2、BMP4基因的研究能提高雌性動物繁殖力，加快優良品種的選育，從而更加合理有效地開發利用品種資源等。

4 結論

本研究通過克隆測序獲得了BMP2基因（GenBank 登錄號為KF492982）與BMP4基因（GenBank 登錄號為KF492983）的編碼區全長cDNA序列，并運用生物信息學相關軟件對所得基因序列及其推導的氨基酸序列進行分析，預測二者均有信號肽，無跨膜區，極有可能是定位于細胞外的分泌型蛋白，并預測了蛋白二級結構、三級結構，通過與其他物種進行同源性分析并構建分子系統進化樹，揭示了川中黑山羊與其他物種進化的一致性，為后續研究提供了一定的理論依據。

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4 結論

本研究通過克隆測序獲得了BMP2基因（GenBank 登錄號為KF492982）與BMP4基因（GenBank 登錄號為KF492983）的編碼區全長cDNA序列，并運用生物信息學相關軟件對所得基因序列及其推導的氨基酸序列進行分析，預測二者均有信號肽，無跨膜區，極有可能是定位于細胞外的分泌型蛋白，并預測了蛋白二級結構、三級結構，通過與其他物種進行同源性分析并構建分子系統進化樹，揭示了川中黑山羊與其他物種進化的一致性，為后續研究提供了一定的理論依據。

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4 結論

本研究通過克隆測序獲得了BMP2基因（GenBank 登錄號為KF492982）與BMP4基因（GenBank 登錄號為KF492983）的編碼區全長cDNA序列，并運用生物信息學相關軟件對所得基因序列及其推導的氨基酸序列進行分析，預測二者均有信號肽，無跨膜區，極有可能是定位于細胞外的分泌型蛋白，并預測了蛋白二級結構、三級結構，通過與其他物種進行同源性分析并構建分子系統進化樹，揭示了川中黑山羊與其他物種進化的一致性，為后續研究提供了一定的理論依據。

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