思茅松SRAP—PCR反應體系的建立與優化

魏博等

摘要：對影響思茅松SRAP-PCR反應體系的各參數進行分析，建立并優化出一套適合思茅松的SRAP-PCR反應體系。在25 μL反應體系中，模板DNA 60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、引物1.0 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶1 U；在此基礎上，從100對引物組合中篩選出條帶清晰、多態性豐富的引物組合24對。

關鍵詞：思茅松；SRAP；體系建立；引物篩選

中圖分類號：S722.3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）03-0027-03

思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）是我國云南省特有樹種，以大面積純林或針闊混交林的形式集中分布于云南省思茅市、臨滄地區、紅河州、西雙版納州和德宏州的部分縣市[1]。思茅松木材廣泛用于建筑、家具制造等行業；其樹干富含樹脂、而且品質優良，已成為除馬尾松、濕地松之外我國重要的松脂資源。近年來，思茅松已成為云南省特別是滇南地區人工造林的主要樹種，在云南省林業產業結構中占有重要地位[2]。

20世紀80年代思茅松的遺傳改良工作就已經開展：種源試驗及優良林分和種源的選擇，為思茅松種子調拔區劃提供科學依據；無性繁殖技術的不斷改良，加速了思茅松良種化的進程[3]；優樹選擇及種子園的建立，為生產提供了寶貴的資源[4]。隨著分子生物學的高速發展，對思茅松的研究也從宏觀進入了分子水平。21世紀初思茅松的遺傳多樣性在同工酶水平得到了研究，并提出了相關的遺傳資源保護策略[5]；隨后，思茅松RAPD、ISSR、AFLP等分子標記的反應體系相繼得以建立[6-8]。

SRAP分子標記技術因操作方便快速、產率高、多態性豐富、易從條帶中得到分離條帶等特點已經在植物遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構建中得到廣泛的應用[9-10]，但在思茅松中的研究未見報道。本研究的目的在于對思茅松的 SRAP-PCR 反應體系的各參數進行分析，在此基礎上建立和優化一套適合思茅松的SRAP-PCR反應體系，并篩選出適合思茅松SRAP反應的引物組合，為思茅松的遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜的構建提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為云南省普洱市思茅區、景谷縣、墨江縣及孟連縣的4個思茅松自然分布群體。從每個群體中隨機采集5株長勢茂盛、植株健壯的思茅松新鮮松針。采集后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和檢測 采用改良的CTAB法對采集樣本的基因組DNA進行提取[11]。利用瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白檢測儀2種方法對提取的思茅松DNA進行純度和濃度的檢測。

1.2.2 引物的合成 參照Li等序列[12]，由北京華大基因科技有限公司合成引物，引物編號和序列見表1。

1.2.3 PCR擴增程序 擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，37 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個循環；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 SRAP-PCR反應體系的優化 在25 μL的反應體系中模板DNA用量依次設置了30、45、60、75、90 ng 5個梯度；Mg2+濃度依次設置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5個梯度；dNTPs濃度依次設置了0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L 5個梯度；Taq DNA聚合酶用量設置了0.25、0.50、0.75、100、1.25 U 5個梯度；引物濃度依次設置了0.25、0.50、075、100、1.25 μmol/L 5個梯度。反應結束后，擴增產物用 15% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.5 引物篩選 利用建立的思茅松SRAP反應體系，采用不同地區的思茅松種源對100對SRAP 引物組合（表1）進行篩選，篩選出條帶清晰、帶型質量好、多態性豐富的引物組合。

2 結果與分析

2.1 DNA檢測

思茅松松針中含有蛋白質、松脂等不利DNA提取的雜質。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，通過改良的CTAB法基本排除了蛋白質和其他雜質的干擾，且在RNA酶作用下，將RNA也去除干凈，經過瓊脂糖凝膠電泳基本能得到整齊、清晰、含雜質較少的DNA條帶，所得DNA純度高（圖1）。核酸蛋白檢測儀檢測后，所有思茅松DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0之間，濃度均達到100 ng/μL以上（表2），表明其純度和濃度均能滿足思茅松SRAP-PCR反應的要求。

2.2 模板DNA用量的優化

電泳結果表明，模板DNA的用量對于PCR擴增結果影響較大，當模板DNA的用量小于60 ng時，擴增產物相對較弱，擴增出的條帶模糊不清晰；當模板DNA用量為60～90 ng 時，擴增出的條帶帶型清晰、穩定、分辨率較高（圖2）。DNA濃度過高會導致模板與引物的直接配對概率降低、模板變性不徹底而引起彌散現象。考慮到節約模板和試驗操作穩定性，在25 μL體系中DNA最佳用量為60 ng。

2.3 Mg2+濃度的優化

試驗結果表明，當Mg2+濃度小于1. 5 mmol/L時，擴增出的條帶較弱、不清晰；當Mg2+濃度大于1.5 mmol/L時，擴增出的條帶相對清晰穩定（圖3）。但考慮到較高Mg2+濃度會產生非特異性擴增，產生非特異性條帶，而且會出現條帶不穩定的彌散現象，在保證特異性PCR產物質量較高、特異性較強的情況下，在25 μL體系中Mg2+最佳濃度為2.0 mmol/L。

2.4 dNTPs濃度的優化

試驗結果表明，dNTPs的濃度小于0.15 mmol/L時，擴增條帶較弱，PCR產物較少，可能是因為dNTPs過早的消耗完而使產物單鏈化導致擴增效果不佳。當dNTPs的濃度為 0.2 mmol/L 時，擴增的條帶穩定、清晰，擴增產物較佳；當濃度為0.25、0.3 mmol/L時條帶明顯增亮（圖4）。最終確定在25 μL體系中dNTPs最佳濃度為0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的優化

試驗結果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U時，合成產物量較少，條帶擴增不明顯；當用量在0.75～1.25 U 之間時，擴增的條帶明亮、清晰（圖5）。考慮到高用量的Taq DNA聚合酶會出現非特異性擴增現象，導致假陽性，甚至出現亮的通帶，Taq DNA聚合酶用量為1 U時， 條帶最清晰穩定、

擴增效果最好，所以在25 μL體系中Taq DNA聚合酶最佳濃度為1 U。

2.6 引物濃度

引物的濃度在一定程度上影響擴增產物的產量。結果表明：引物濃度在0.25～0.50 μmol/L之間時，其擴增產物產量較少，條帶明顯較暗。只有在1.0 μmol/L時條帶清晰穩定，擴增效果最好（圖6）。由于引物濃度過高會產生非特異性擴增和錯配，導致引物二聚體的產生，最終確定1.0 μmol/L引物濃度為最佳反應濃度。

2.7 引物篩選

根據建立和優化的SRAP-PCR反應體系，采用4個群體共20個個體對100對SRAP引物組合進行篩選，最終篩選出Me1-Em3（圖7）等24對多態性好、擴增結果穩定的引物組合（表3）。

SRAP 標記不需要知道任何基因的序列信息即可進行 PCR 擴增，具有共顯性簡便、穩定、操作簡單、重復性強等優點，因此SRAP 技術在林木遺傳育種中得到了廣泛的應用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子標記技術受到反應條件的影響，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度以及反應程序等，因此在利用SRAP分子標記時首先應對其反應體系進行優化，以保證分析結果的可靠性。本研究對PCR反應中的各影響因子都設計了5個梯度，通過反復試驗，最終確定了優化后的思茅松SRAP反應體系，該體系總體積為25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+濃度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子標記多態性產生的原因在于上游引物與下游引物分別與外顯子區域和內含子、啟動子區域結合，而內含子和啟動子區域在不同個體、物種中又存在差異。可見，SRAP分子標記中多態性條帶的獲得取決于引物與基因組的結合狀態。本研究建立的SRAP-PCR反應體系，與太行菊[13]、茶樹[14]、柱花草[15]、華山松[16]等都有不同，說明不同物種的SRAP-PCR反應體系有一定差異。在此基礎上利用建立的思茅松SRAP-PCR體系成功地從100對引物組合中篩選出24對條帶清晰、多態性豐富的引物組合。表明這套思茅松SRAP-PCR反應體系穩定、可靠，為后續的思茅松遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜構建奠定了技術基礎。

參考文獻：

[1]耿樹香，尹曉兵. 思茅松樹脂酸熱異構反應的研究[J]. 林業實用技術，2011（6）：58-60.

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[9]周冬琴，莫海波，蘆治國，等. 基于SRAP標記的墨西哥落羽杉優良單株的遺傳多樣性分析[J]. 植物資源與環境學報，2012，21（1）：36-41.

[10]齊 蘭，王文泉，張振文，等. 利用SRAP標記構建18個木薯品種的DNA指紋圖譜[J]. 作物學報，2010，36（10）：1642-1648.

[11]王大瑋，李 煜，周 瑋，等. 杜仲AFLP反應體系的建立及優化[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2010，38（6）：88-94.

[12]Li G，Quiors C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455-461.

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[14]劉 振，趙 洋，楊培迪，等. 茶樹SRAP反應體系優化及引物篩選[J]. 茶葉通訊，2012，39（4）：18-21.

[15]張偉麗，劉鳳民，劉 艾. 柱花草SRAP-PCR體系優化及其遺傳多樣性分析[J]. 草業學報，2011，20（4）：159-168.

[16]趙 楊，李玉璞，代 毅. 華山松SRAP-PCR反應體系的優化[J]. 西北林學院學報，2012，27（5）：87-90，173.

試驗結果表明，dNTPs的濃度小于0.15 mmol/L時，擴增條帶較弱，PCR產物較少，可能是因為dNTPs過早的消耗完而使產物單鏈化導致擴增效果不佳。當dNTPs的濃度為 0.2 mmol/L 時，擴增的條帶穩定、清晰，擴增產物較佳；當濃度為0.25、0.3 mmol/L時條帶明顯增亮（圖4）。最終確定在25 μL體系中dNTPs最佳濃度為0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的優化

試驗結果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U時，合成產物量較少，條帶擴增不明顯；當用量在0.75～1.25 U 之間時，擴增的條帶明亮、清晰（圖5）。考慮到高用量的Taq DNA聚合酶會出現非特異性擴增現象，導致假陽性，甚至出現亮的通帶，Taq DNA聚合酶用量為1 U時， 條帶最清晰穩定、

擴增效果最好，所以在25 μL體系中Taq DNA聚合酶最佳濃度為1 U。

2.6 引物濃度

引物的濃度在一定程度上影響擴增產物的產量。結果表明：引物濃度在0.25～0.50 μmol/L之間時，其擴增產物產量較少，條帶明顯較暗。只有在1.0 μmol/L時條帶清晰穩定，擴增效果最好（圖6）。由于引物濃度過高會產生非特異性擴增和錯配，導致引物二聚體的產生，最終確定1.0 μmol/L引物濃度為最佳反應濃度。

2.7 引物篩選

根據建立和優化的SRAP-PCR反應體系，采用4個群體共20個個體對100對SRAP引物組合進行篩選，最終篩選出Me1-Em3（圖7）等24對多態性好、擴增結果穩定的引物組合（表3）。

SRAP 標記不需要知道任何基因的序列信息即可進行 PCR 擴增，具有共顯性簡便、穩定、操作簡單、重復性強等優點，因此SRAP 技術在林木遺傳育種中得到了廣泛的應用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子標記技術受到反應條件的影響，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度以及反應程序等，因此在利用SRAP分子標記時首先應對其反應體系進行優化，以保證分析結果的可靠性。本研究對PCR反應中的各影響因子都設計了5個梯度，通過反復試驗，最終確定了優化后的思茅松SRAP反應體系，該體系總體積為25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+濃度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子標記多態性產生的原因在于上游引物與下游引物分別與外顯子區域和內含子、啟動子區域結合，而內含子和啟動子區域在不同個體、物種中又存在差異。可見，SRAP分子標記中多態性條帶的獲得取決于引物與基因組的結合狀態。本研究建立的SRAP-PCR反應體系，與太行菊[13]、茶樹[14]、柱花草[15]、華山松[16]等都有不同，說明不同物種的SRAP-PCR反應體系有一定差異。在此基礎上利用建立的思茅松SRAP-PCR體系成功地從100對引物組合中篩選出24對條帶清晰、多態性豐富的引物組合。表明這套思茅松SRAP-PCR反應體系穩定、可靠，為后續的思茅松遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜構建奠定了技術基礎。

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試驗結果表明，dNTPs的濃度小于0.15 mmol/L時，擴增條帶較弱，PCR產物較少，可能是因為dNTPs過早的消耗完而使產物單鏈化導致擴增效果不佳。當dNTPs的濃度為 0.2 mmol/L 時，擴增的條帶穩定、清晰，擴增產物較佳；當濃度為0.25、0.3 mmol/L時條帶明顯增亮（圖4）。最終確定在25 μL體系中dNTPs最佳濃度為0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的優化

試驗結果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U時，合成產物量較少，條帶擴增不明顯；當用量在0.75～1.25 U 之間時，擴增的條帶明亮、清晰（圖5）。考慮到高用量的Taq DNA聚合酶會出現非特異性擴增現象，導致假陽性，甚至出現亮的通帶，Taq DNA聚合酶用量為1 U時， 條帶最清晰穩定、

擴增效果最好，所以在25 μL體系中Taq DNA聚合酶最佳濃度為1 U。

2.6 引物濃度

引物的濃度在一定程度上影響擴增產物的產量。結果表明：引物濃度在0.25～0.50 μmol/L之間時，其擴增產物產量較少，條帶明顯較暗。只有在1.0 μmol/L時條帶清晰穩定，擴增效果最好（圖6）。由于引物濃度過高會產生非特異性擴增和錯配，導致引物二聚體的產生，最終確定1.0 μmol/L引物濃度為最佳反應濃度。

2.7 引物篩選

根據建立和優化的SRAP-PCR反應體系，采用4個群體共20個個體對100對SRAP引物組合進行篩選，最終篩選出Me1-Em3（圖7）等24對多態性好、擴增結果穩定的引物組合（表3）。

SRAP 標記不需要知道任何基因的序列信息即可進行 PCR 擴增，具有共顯性簡便、穩定、操作簡單、重復性強等優點，因此SRAP 技術在林木遺傳育種中得到了廣泛的應用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子標記技術受到反應條件的影響，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度以及反應程序等，因此在利用SRAP分子標記時首先應對其反應體系進行優化，以保證分析結果的可靠性。本研究對PCR反應中的各影響因子都設計了5個梯度，通過反復試驗，最終確定了優化后的思茅松SRAP反應體系，該體系總體積為25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+濃度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子標記多態性產生的原因在于上游引物與下游引物分別與外顯子區域和內含子、啟動子區域結合，而內含子和啟動子區域在不同個體、物種中又存在差異。可見，SRAP分子標記中多態性條帶的獲得取決于引物與基因組的結合狀態。本研究建立的SRAP-PCR反應體系，與太行菊[13]、茶樹[14]、柱花草[15]、華山松[16]等都有不同，說明不同物種的SRAP-PCR反應體系有一定差異。在此基礎上利用建立的思茅松SRAP-PCR體系成功地從100對引物組合中篩選出24對條帶清晰、多態性豐富的引物組合。表明這套思茅松SRAP-PCR反應體系穩定、可靠，為后續的思茅松遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜構建奠定了技術基礎。

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