基于線粒體COⅠ基因的大小蠹屬昆蟲DNA條形碼研究

花婧等

摘要：大小蠹屬昆蟲是重要的林木害蟲，大部分種類是檢疫性有害生物，我國口岸有多次截獲記錄。為加強對大小蠹屬害蟲的檢疫鑒定，通過線粒體DNA細胞色素氧化酶C亞基Ⅰ基因（COⅠ）867 bp片段序列對大小蠹屬17個種類進行序列分析，結果表明，線粒體COⅠ基因可作為大小蠹屬昆蟲分類的依據；DNA條形碼是生物系統分類分子水平上的依據。

關鍵詞：大小蠹屬；線粒體基因；遺傳距離；COⅠ基因

中圖分類號： S763.380.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0030-03

目前，世界范圍內已報道大小蠹屬（Dendroctonus）昆蟲19種[1-2]，作為鞘翅目中最進化的1個類群，其危害范圍較廣，是重要的森林害蟲。大小蠹屬為樹皮小蠹類[3-4]，全部種類均侵食樹干，成蟲時初入侵韌皮部，后筑母坑道于形成層與邊材之間。一般情況下，大小蠹屬只危害活的直立木和由于年齡、干旱或其他生物學因素導致的衰弱木，在盛發期也危害茁壯的健康樹，寄主包括松屬、云杉屬、黃杉屬和落葉松屬等經濟樹種。

目前，昆蟲鑒定以傳統的形態學鑒定為主，該方法存在一定的缺陷，表型可塑性（phenotypic plasticity）和遺傳可變性（genetic variability）容易造成鑒定結果不正確，無法鑒定許多群體中普遍存在的隱存分類單元，受生物性別和發育階段的限制，很多生物無法被鑒定。現代交互式鑒定系統是昆蟲鑒定的一個很大進步，但它要求專業技術很高，操作不正確就易導致鑒定錯誤[5]。快速準確的物種鑒定是深入開展行為學、生態學以及生理學等相關研究的必要前提和基礎[6]。

國內外大小蠹研究多集中于形態學分類，有關該類群分子鑒定技術的研究報道尚少。本研究通過對大小蠹屬COⅠ基因片段序列進行比對，對同源序列堿基多樣性及系統進化關系進行分析，以期利用DNA條形碼技術快速、準確地鑒定大小蠹種類，為進一步研究小蠹科昆蟲分子鑒定技術提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 昆蟲種類及序列信息

本研究以大小蠹屬17個種類作為研究對象（表1），序列均從GenBank下載。

1.2 分析方法

應用MEGA5.05軟件進行序列比對、拼接和剪切，基于Kimura 2-parameter模型，計算各分類單元之間的遺傳距離及其標準差、序列堿基組成、保守位點、變異位點、轉換/顛換比值等[7]。應用MEGA5.05軟件，使用鄰接法（NJ）構建分子系統樹，1 000次循環估計系統樹中節點的自舉置信水平，堿基轉換和顛換賦予相同的加權值，查看系統樹[8]。

2 結果與分析

2.1 mtDNA COⅠ基因序列組成和變異

應用MEGA 5.05軟件對17個大小蠹COⅠ基因序列比

對剪齊后保留了869 bp的序列，其中第1個堿基為第1個氨基酸密碼子的啟示位點，為分析方便，共保留867 bp進行序列分析。結果表明，在867個位點中沒有插入和缺失現象，其中保守位點、變異位點和簡約信息位點分別為525個、342個和248個，在867個位點中分別占60.6%、39.4%和286%；A、T、C、G平均含量分別為30.2%、37.9%、16.8%、15.1%，A+T含量較高，為68.1%。另外，雖然不同密碼子的A、T、C、G含量不相同，但都表現出明顯的A+T含量偏向性，特別是在密碼子的第3位，A+T含量高達83.1%，與典型的昆蟲線粒體DNA堿基組成一致。密碼子第3位點G含量較少，只有4.6%，并且在不同種間差異較大（2.1%～74%），C含量在不同種群間差異也很大（6.4%～20.9%）。

2.2 堿基替換分析

采用MEGA5.05軟件對所測基因序列替換數進行估計，由表2可見，17種大小蠹COⅠ基因867個核苷酸序列中，核苷酸替換多為同義替換（ii）。全組數據轉換與顛換的平均比值為1.79，在第1、2、3位點的比值分別為3.63、1.68、1.58，轉換較為頻繁，這是昆蟲mtDNA的一個普遍特點；轉換發生以CT為主（73.0%），顛換以AT為主（933%）。轉換與顛換主要發生在密碼子第3位點上，轉換58個，其頻率為總數的77.3%，顛換37個，其頻率為總數的881%；第2位點最少，只有2個位點發生了轉換，1個位點發生了顛換，這與第3位點承擔較小的遺傳壓力有關。

2.3 遺傳距離分析

在分子進化過程中，多重替換的存在嚴重干擾了序列之間真正的遺傳距離估算，很難直接從已對準的序列中計算出真正的遺傳距離。要解決這個問題，就需要對多重替換影響下的序列進行校正。現在有一些方法對序列進化過程作出了不同的假設，在這些假設條件下來估計序列上核苷酸的替換數目。參數越多，對進化過程的描述就越具體和詳細，相對計算也越復雜。

基于Kimura 2-parameter，采用MEGA5.05軟件分析大小蠹屬17種昆蟲之間的遺傳距離[9]，并采用Bootstrap重抽樣1 000次進行檢驗。由表3可見，大小蠹屬17種昆蟲平均遺傳距離為0.145，屬間遺傳距離介于0.083～0.191之間（>2%）。雖然大小蠹屬各物種之間的親緣關系十分接近，但可以達到分子水平不同種的鑒定要求。

2.4 大小蠹屬NJ系統發育重建

以楝星天牛（Anoplophora horsfieldi）為外群，采用MEGA5.05構建大小蠹屬17個種的NJ分子系統樹，從構建的NJ樹（圖1）來看，華山松大小蠹、杰松大小蠹、山松大小蠹聚為1支，科羅大小蠹、西部松大小蠹、間大小蠹、墨西哥大小蠹、南部松大小蠹聚為1支，黃杉大小蠹和落葉松大小蠹聚為1支，根大小蠹、紅脂大小蠹、黑脂大小蠹聚為1支，剩余幾種聚為1支，形成5大支格局。其中，華山松大小蠹、杰松大小蠹、山松大小蠹一支分化最快，依次為南部松大小蠹所在支、黃杉大小蠹和落葉松大小蠹所在支、根大小蠹所在支，云杉大小蠹所在支分化最慢，這與形態學分類相一致。如山松大小蠹與杰松大小蠹、黃杉松大小蠹和落葉松大小蠹在形態學上相似，在分子系統進化樹上也同樣關系相近，且從遺傳距離（表2）看，兩者的遺傳距離分別為0.083和0.092（>2%），說明該段序列能夠作為分子鑒定的依據。

3 小結與討論

Hebert等對包括脊椎動物和無脊椎動物界的COⅠ基因序列比較分析，得出除腔腸動物外、98%物種的種內遺傳距離差異為0%～2%的結論。本研究各種大小蠹昆蟲間的遺傳距離表明，該片段在種間平均距離為0.145，可以較好區分大小蠹屬的不同種類。同時，基于Kimura 2-parameter雙參數模型構建的NJ樹結果與形態學分類結果基本一致，能滿足種類鑒定的需要。

本研究利用NCBI中已公開的部分大小蠹COⅠ序列，通過線粒體COⅠ基因序列比較，分析各種間遺傳距離及系統進化樹構建，發現利用該段序列能夠較好地區分近緣種，且與形態學分類相似度高，證實了基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術在小蠹科大小蠹屬昆蟲分子鑒定上具有可行性，既能夠解決植物檢疫中截獲的大小蠹幼蟲或殘缺成蟲的鑒定問題，又能為小蠹科昆蟲DNA條形碼數據庫的構建提供理論依據及實踐基礎。

參考文獻：

[1]Wood S L. The bark and ambrosia beetles of north and central America（Coleoptera：Scolytidae），a taxonomic monograph[M]. Prove：Brigham Young University，1982.

[2]殷惠芬，黃復生，李兆麟. 中國經濟昆蟲志 第29冊：鞘翅目小蠹科[M]. 北京：科學出版社，1984：56-58.

[3]Diaze E，Cisnerosr R，Zunigag G，et al. Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis，D. rhizophagus，and D. valens（Coleoptera：Scolytidae）[J]. Annals of Entomological Society of America，1998，91（4）：479-487.

[4]Hopkins A D. Contributions toward a monograph of the scolytid beetles[M]. USDA：Bureau of Entomology Technical Bulletin，1909.

[5]劉 勇，宋 毓，李曉宇. 基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術在昆蟲分子鑒定中的應用[J]. 植物檢疫，2010，24（2）：46-50.

[6]Dayrat B. Towards integrative taxonomy[J]. Biol J Linn Soc，2005，85（3）：407-415.

[7]蔣 青，梁憶冰，王乃揚，等. 有害生物危險性評價的定量分析方法研究[J]. 植物檢疫，1995，9（4）：208-211.

[8]田 鵬，劉占林. 分子系統發育樹構建的簡易方法[J]. 生物信息學，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 緣蝽科昆蟲線粒體COⅠ基因的分子系統學研究（半翅目：異翅亞目）[D]. 西安：陜西師范大學，2007：1-57.

3 小結與討論

Hebert等對包括脊椎動物和無脊椎動物界的COⅠ基因序列比較分析，得出除腔腸動物外、98%物種的種內遺傳距離差異為0%～2%的結論。本研究各種大小蠹昆蟲間的遺傳距離表明，該片段在種間平均距離為0.145，可以較好區分大小蠹屬的不同種類。同時，基于Kimura 2-parameter雙參數模型構建的NJ樹結果與形態學分類結果基本一致，能滿足種類鑒定的需要。

本研究利用NCBI中已公開的部分大小蠹COⅠ序列，通過線粒體COⅠ基因序列比較，分析各種間遺傳距離及系統進化樹構建，發現利用該段序列能夠較好地區分近緣種，且與形態學分類相似度高，證實了基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術在小蠹科大小蠹屬昆蟲分子鑒定上具有可行性，既能夠解決植物檢疫中截獲的大小蠹幼蟲或殘缺成蟲的鑒定問題，又能為小蠹科昆蟲DNA條形碼數據庫的構建提供理論依據及實踐基礎。

參考文獻：

[1]Wood S L. The bark and ambrosia beetles of north and central America（Coleoptera：Scolytidae），a taxonomic monograph[M]. Prove：Brigham Young University，1982.

[2]殷惠芬，黃復生，李兆麟. 中國經濟昆蟲志 第29冊：鞘翅目小蠹科[M]. 北京：科學出版社，1984：56-58.

[3]Diaze E，Cisnerosr R，Zunigag G，et al. Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis，D. rhizophagus，and D. valens（Coleoptera：Scolytidae）[J]. Annals of Entomological Society of America，1998，91（4）：479-487.

[4]Hopkins A D. Contributions toward a monograph of the scolytid beetles[M]. USDA：Bureau of Entomology Technical Bulletin，1909.

[5]劉 勇，宋 毓，李曉宇. 基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術在昆蟲分子鑒定中的應用[J]. 植物檢疫，2010，24（2）：46-50.

[6]Dayrat B. Towards integrative taxonomy[J]. Biol J Linn Soc，2005，85（3）：407-415.

[7]蔣 青，梁憶冰，王乃揚，等. 有害生物危險性評價的定量分析方法研究[J]. 植物檢疫，1995，9（4）：208-211.

[8]田 鵬，劉占林. 分子系統發育樹構建的簡易方法[J]. 生物信息學，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 緣蝽科昆蟲線粒體COⅠ基因的分子系統學研究（半翅目：異翅亞目）[D]. 西安：陜西師范大學，2007：1-57.

3 小結與討論

Hebert等對包括脊椎動物和無脊椎動物界的COⅠ基因序列比較分析，得出除腔腸動物外、98%物種的種內遺傳距離差異為0%～2%的結論。本研究各種大小蠹昆蟲間的遺傳距離表明，該片段在種間平均距離為0.145，可以較好區分大小蠹屬的不同種類。同時，基于Kimura 2-parameter雙參數模型構建的NJ樹結果與形態學分類結果基本一致，能滿足種類鑒定的需要。

本研究利用NCBI中已公開的部分大小蠹COⅠ序列，通過線粒體COⅠ基因序列比較，分析各種間遺傳距離及系統進化樹構建，發現利用該段序列能夠較好地區分近緣種，且與形態學分類相似度高，證實了基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術在小蠹科大小蠹屬昆蟲分子鑒定上具有可行性，既能夠解決植物檢疫中截獲的大小蠹幼蟲或殘缺成蟲的鑒定問題，又能為小蠹科昆蟲DNA條形碼數據庫的構建提供理論依據及實踐基礎。

參考文獻：

[1]Wood S L. The bark and ambrosia beetles of north and central America（Coleoptera：Scolytidae），a taxonomic monograph[M]. Prove：Brigham Young University，1982.

[2]殷惠芬，黃復生，李兆麟. 中國經濟昆蟲志 第29冊：鞘翅目小蠹科[M]. 北京：科學出版社，1984：56-58.

[3]Diaze E，Cisnerosr R，Zunigag G，et al. Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis，D. rhizophagus，and D. valens（Coleoptera：Scolytidae）[J]. Annals of Entomological Society of America，1998，91（4）：479-487.

[4]Hopkins A D. Contributions toward a monograph of the scolytid beetles[M]. USDA：Bureau of Entomology Technical Bulletin，1909.

[5]劉 勇，宋 毓，李曉宇. 基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術在昆蟲分子鑒定中的應用[J]. 植物檢疫，2010，24（2）：46-50.

[6]Dayrat B. Towards integrative taxonomy[J]. Biol J Linn Soc，2005，85（3）：407-415.

[7]蔣 青，梁憶冰，王乃揚，等. 有害生物危險性評價的定量分析方法研究[J]. 植物檢疫，1995，9（4）：208-211.

[8]田 鵬，劉占林. 分子系統發育樹構建的簡易方法[J]. 生物信息學，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 緣蝽科昆蟲線粒體COⅠ基因的分子系統學研究（半翅目：異翅亞目）[D]. 西安：陜西師范大學，2007：1-57.