沙棘葉片總RNA提取方法的比較研究

李小婷等

摘要：沙棘葉片富含多糖、多酚、蛋白質、類黃酮等次生代謝物質，用普通方法提取沙棘葉片總RNA時很難將其去除。本試驗以沙棘葉片為材料，比較研究了改良Trizol法、 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）、RNAplant Plus總RNA提取試劑以及RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法等4種方法對沙棘葉片總RNA的提取效果。結果表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法能從沙棘葉片中提取純度較高的RNA，凝膠電泳顯示條帶清晰完整，鮮葉平均得率為298.1 μg/g，D260 nm/D280 nm 比值為1.79，用該方法提取的沙棘葉片總RNA可以用于后續的分子生物學研究中。

關鍵詞：沙棘葉片；總RNA提取；提取方法

中圖分類號： S793.604 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0033-02

提取獲得純度高、質量好的RNA是進行cDNA第一鏈合成、RT-PCR、RACE-PCR、cDNA全長克隆和Northern雜交等分子生物學研究的必要前提[1-2]。沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），又名醋柳、酸刺，是胡頹子科沙棘屬（Hippophae）的灌木或小喬木。沙棘廣泛分布于黃土高原、毛烏素沙地及其毗鄰地區，在水土保持、防風固沙及治理砒砂巖等方面發揮著重要的生態作用[3]。沙棘葉片中含有大量的多糖、多酚、粗蛋白、類黃酮等次生代謝物質[4]，加之RNAase的廣泛存在，使獲得純度較高的沙棘葉片總RNA變得十分困難。傳統提取RNA的方法有異硫氰酸胍法、苯酚法、SDS法、CTAB法、Tris-硼酸法及Trizol法等，這些方法可以有效地提取大部分動物組織RNA，但高等植物組織內含有一些多糖類和酚類物質，使用這些方法很難去除[5]。本試驗采用4種RNA提取試劑 （盒） 進行系統比較分析，以期篩選出提取高質量沙棘葉片總RNA的方法，為開展沙棘后續分子生物研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的沙棘葉片采自陜西省定邊縣西南林業大學實習基地，為移栽后2年的實生苗嫩葉，采后迅速放入液氮中帶回實驗室-80 ℃保存。

試驗所用主要試劑有Trizol （Invitrogen公司產品）、RNA simple 總RNA提取試劑盒 （離心柱型） （天根公司產品）、RNAplant Plus 總RNA提取試劑 （天根公司產品），DEPC （Sigma公司），其他試劑均為RNA試驗專用。

1.2 方法

1.2.1 改良Trizol法 按照Invitrogen 公司試劑說明書進行，并加以改進：取0.1 g沙棘葉片液氮研磨成細粉后加 0.1 g PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 繼續研磨，待液氮揮發后將混合粉末迅速加入已裝好Trizol的1.5 mL無RNAase離心管中，搖勻前迅速加入10 μL β-巰基乙醇；加入氯仿之前加 200 μL 5 mol/L NaCl 混勻；氯仿抽提，取上清后加入等體積酚-氯仿-異戊醇（體積比25 ∶ 24 ∶ 1），重新抽提1次。

1.2.2 RNAsimple總RNA提取試劑盒（離心柱型） 參照天根公司試劑盒說明書進行。

1.2.3 RNAplant Plus總RNA提取試劑法 參照天根公司試劑說明書進行。使用前按照1 ∶ 4的體積比將β-巰基乙醇與RNAplant Plus reagent混合。

1.2.4 RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法 在加氯仿之前按1 ∶ 250的體積比加入DNA酶Ⅰ，輕輕吹打混勻 1 min，然后參照天根公司試劑說明書進行。

1.2.5 總RNA的完整性檢測 分別取5μL總RNA樣品，在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測，EB（溴化乙錠）中染色后，凝膠成像系統成像觀察，記錄結果。

1.2.6 總RNA的純度檢測 將用4種方法提取的總RNA分別取2 μL，用無RNAase的DEPC水稀釋50倍，在核酸蛋白儀上測定D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm值，分析其純度。

得率（μg/g）=D260 nm×40（μg/mL）×稀釋倍數×RNA原液體積（mL）/所取樣品質量（g）。

2 結果與分析

2.1 沙棘葉片總RNA完整性分析

4種不同方法提取的RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳 （圖1），結果表明，改良TRIzol法和RNAsimple 總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 的凝膠電泳未檢測出RNA；RNAplant Plus 總RNA提取試劑法得到的沙棘總RNA電泳圖譜可以看到亮度很高的28S和18S 2條帶，且28 條帶與18S條帶亮度比約為2 ∶ 1，但在28S上方可見明顯的其他條帶，表明有基因組DNA雜質；而RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ之后成功地去除了DNA，并且對總RNA質量、濃度影響不大。

2.2 沙棘葉片總RNA純度分析

用改良Trizol法、 RNAsimple 總RNA提取試劑盒 （離心

柱型）、RNAplant Plus總RNA提取試劑法以及RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法4種方法提取沙棘葉片總RNA，在核酸蛋白儀上進行分析，結果如表1所示。

一般認為較純凈的RNA樣品，其D260 nm/D280 nm應為 1.7～2.0，D260 nm/D230 nm應大于2.0。由表1可見，改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒 （離心柱型）提取的RNA的D260 nm/D280 nm分別為1.47和1.28，均小于1.7，表明這2種方法提取的RNA樣品純度較差，不能有效去除總RNA樣品中蛋白質或酚類等有機物雜質。同時，這2種方法提取的總RNA樣品的D260 nm/D230 nm分別為0.33和0.79，表明這2種方法也不能有效地去除其中的萜類化合物等次生代謝物。RNAplant Plus總RNA提取試劑法提取法的RNA樣品D260 nm/D280 nm大于1.7，表明這種方法可以去除蛋白質和酚類物質的干擾；但D260 nm/D230 nm小于2.0，可能是受到基因組DNA的干擾。而RNplant Plus 總RNA提取試劑改良法提取的RNA D260 nm/D280 nm為1.79，D260 nm/D230 nm為2.07，表明這種方法提取的RNA純度高，不存在多糖、蛋白質及酚類物質等雜質。

改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）2種方法獲得的總RNA得率都很低，分別為55.1、33.7 μg/g （RNA/樣品）；而RNAplant Plus總RNA提取試劑法和RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法的總RNA得率都較高，但RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法的RNA產率為298.1 μg/g，低于RNAplant Plus總RNA提取試劑法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ對RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA產量有所下降，也可能是后者對DNA的去除不徹底，對RNA的得率有所影響。

從試驗所需時間上來看，改良Trizol法所需時間最長，需 6.0 h；而其他3種方法所需時間相差不大，均為3 h左右（表1）。

試驗數據綜合表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法是提取沙棘葉片RNA的最佳方法。

3 結論與討論

RNA的純度和完整性是分子生物學試驗成功的關鍵性因素[1-2]。在植物細胞中，多糖和酚類物質與核酸在空間上是相互分離的，但對組織進行研磨破碎后，它們會與RNA相互作用，從而影響RNA的提取及后續反應[6]。多糖的理化性質與核酸極為相似，往往在去除多糖的同時造成RNA產量的下降[7-8]；而酚類物質殘留在樣品中會發生氧化產生深褐色的物質[9]，所以使用傳統方法提取的RNA往往帶有很深的鐵銹色。而且RNase活性很強，整個試驗過程中，微量的外源RNase或內源RNase都會使RNA發生降解，因此，在RNA提取過程中必須抑制RNase活性并克服這些次生代謝產物的干擾，從而得到質量較好、純度較高的RNA[10-11]。

Trizol內含異硫氰酸胍等變性劑，改良Ttizol法在提取過程中加入PVP、β-巰基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等雜質，孫德權等[12]、蘇丹等[13]用改良Trizol法獲得了富含多糖、多酚類次生代謝物質的香蕉葉片和辣椒組織的總RNA。RNAsimple總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 使用了硅基質膜，以增強對RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用該種方法成功獲得了墨蘭舌瓣的總RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同組織所含次生代謝物質的種類和含量有所差異，而這些次生代謝物質往往是影響RNA提取效果的關鍵因素之一[15]，用這2種方法提取的沙棘葉片總RNA并不理想，因此這2種方法并不適用于沙棘葉片RNA的提取。

RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ后，雖對RNA得率有所影響，但有效地去除了RNA中的基因組DNA的干擾，同時對RNA的質量影響不大。而且這種方法提取RNA所需時間較短，操作簡單，是目前提取沙棘葉片總RNA的理想方法。

改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）2種方法獲得的總RNA得率都很低，分別為55.1、33.7 μg/g （RNA/樣品）；而RNAplant Plus總RNA提取試劑法和RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法的總RNA得率都較高，但RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法的RNA產率為298.1 μg/g，低于RNAplant Plus總RNA提取試劑法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ對RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA產量有所下降，也可能是后者對DNA的去除不徹底，對RNA的得率有所影響。

從試驗所需時間上來看，改良Trizol法所需時間最長，需 6.0 h；而其他3種方法所需時間相差不大，均為3 h左右（表1）。

試驗數據綜合表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法是提取沙棘葉片RNA的最佳方法。

3 結論與討論

RNA的純度和完整性是分子生物學試驗成功的關鍵性因素[1-2]。在植物細胞中，多糖和酚類物質與核酸在空間上是相互分離的，但對組織進行研磨破碎后，它們會與RNA相互作用，從而影響RNA的提取及后續反應[6]。多糖的理化性質與核酸極為相似，往往在去除多糖的同時造成RNA產量的下降[7-8]；而酚類物質殘留在樣品中會發生氧化產生深褐色的物質[9]，所以使用傳統方法提取的RNA往往帶有很深的鐵銹色。而且RNase活性很強，整個試驗過程中，微量的外源RNase或內源RNase都會使RNA發生降解，因此，在RNA提取過程中必須抑制RNase活性并克服這些次生代謝產物的干擾，從而得到質量較好、純度較高的RNA[10-11]。

Trizol內含異硫氰酸胍等變性劑，改良Ttizol法在提取過程中加入PVP、β-巰基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等雜質，孫德權等[12]、蘇丹等[13]用改良Trizol法獲得了富含多糖、多酚類次生代謝物質的香蕉葉片和辣椒組織的總RNA。RNAsimple總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 使用了硅基質膜，以增強對RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用該種方法成功獲得了墨蘭舌瓣的總RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同組織所含次生代謝物質的種類和含量有所差異，而這些次生代謝物質往往是影響RNA提取效果的關鍵因素之一[15]，用這2種方法提取的沙棘葉片總RNA并不理想，因此這2種方法并不適用于沙棘葉片RNA的提取。

RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ后，雖對RNA得率有所影響，但有效地去除了RNA中的基因組DNA的干擾，同時對RNA的質量影響不大。而且這種方法提取RNA所需時間較短，操作簡單，是目前提取沙棘葉片總RNA的理想方法。

改良Trizol法和 RNAsimple 總RNA提取試劑盒（離心柱型）2種方法獲得的總RNA得率都很低，分別為55.1、33.7 μg/g （RNA/樣品）；而RNAplant Plus總RNA提取試劑法和RNAplant Plus 總RNA提取試劑改良法的總RNA得率都較高，但RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法的RNA產率為298.1 μg/g，低于RNAplant Plus總RNA提取試劑法的433.4 μg/g（表1），可能是由于前者加入的DNA酶Ⅰ對RNA也起到了一定的降解作用，造成了RNA產量有所下降，也可能是后者對DNA的去除不徹底，對RNA的得率有所影響。

從試驗所需時間上來看，改良Trizol法所需時間最長，需 6.0 h；而其他3種方法所需時間相差不大，均為3 h左右（表1）。

試驗數據綜合表明，RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法是提取沙棘葉片RNA的最佳方法。

3 結論與討論

RNA的純度和完整性是分子生物學試驗成功的關鍵性因素[1-2]。在植物細胞中，多糖和酚類物質與核酸在空間上是相互分離的，但對組織進行研磨破碎后，它們會與RNA相互作用，從而影響RNA的提取及后續反應[6]。多糖的理化性質與核酸極為相似，往往在去除多糖的同時造成RNA產量的下降[7-8]；而酚類物質殘留在樣品中會發生氧化產生深褐色的物質[9]，所以使用傳統方法提取的RNA往往帶有很深的鐵銹色。而且RNase活性很強，整個試驗過程中，微量的外源RNase或內源RNase都會使RNA發生降解，因此，在RNA提取過程中必須抑制RNase活性并克服這些次生代謝產物的干擾，從而得到質量較好、純度較高的RNA[10-11]。

Trizol內含異硫氰酸胍等變性劑，改良Ttizol法在提取過程中加入PVP、β-巰基乙醇以及NaCl以去除多糖、多酚等雜質，孫德權等[12]、蘇丹等[13]用改良Trizol法獲得了富含多糖、多酚類次生代謝物質的香蕉葉片和辣椒組織的總RNA。RNAsimple總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 使用了硅基質膜，以增強對RNA的吸附能力，朱永平等[14]利用該種方法成功獲得了墨蘭舌瓣的總RNA。但可能是由于不同植物及同一植物的不同組織所含次生代謝物質的種類和含量有所差異，而這些次生代謝物質往往是影響RNA提取效果的關鍵因素之一[15]，用這2種方法提取的沙棘葉片總RNA并不理想，因此這2種方法并不適用于沙棘葉片RNA的提取。

RNAplant Plus總RNA提取試劑改良法在加入DNA酶Ⅰ后，雖對RNA得率有所影響，但有效地去除了RNA中的基因組DNA的干擾，同時對RNA的質量影響不大。而且這種方法提取RNA所需時間較短，操作簡單，是目前提取沙棘葉片總RNA的理想方法。