不同寄主上南方根結線蟲的ISSR—PCR鑒別

思彬彬+張學娟+張靠穩

摘要：以南方根結線蟲雌蟲DNA為基礎，通過ISSR-PCR分子標記鑒別出寄生在黃瓜和番茄上的南方根結線蟲。本試驗中ISSR-PCR反應體系25 μL，各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通過對50個ISSR引物的篩選，得到1個引物841，該引物能將寄生在不同寄主上的南方根結線蟲加以鑒別。

關鍵詞：南方根結線蟲；雌蟲；ISSR-PCR；鑒別；引物

中圖分類號： S432.4+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）是一種分布廣、危害嚴重的植物寄生線蟲[1]，通過其在侵染的寄主植物上的寄生行為直接引起作物的產量損失。傳統方法主要根據根結線蟲形態學進行鑒定和分類，但由于其較大的變異性導致有時結果不夠準確[2]。本試驗將南方根結線蟲形態學和 ISSR-PCR 分子標記的方法相結合，研究了賀蘭山軍馬場不同寄主上南方根結線蟲中種群的種類，為今后寧夏地區南方根結線蟲病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 南方根結線蟲樣本的采集

2012年1月在賀蘭山軍馬場溫棚采集有大量根結的黃瓜根部組織；2012年7月分別在賀蘭山軍馬場露天采集有大量根結的番茄根部組織。

1.2 南方根結線蟲的形態學鑒定

依據參考文獻[2]，分別觀察黃瓜和番茄根結中的根結線蟲雌蟲會陰花紋。

1.3 2種寄主根部南方根結線蟲DNA的提取

提取方法根據參考文獻[3]

1.4 2種不同寄主上南方根結線蟲的ISSR-PCR擴增

利用單因素試驗與正交設計試驗相結合的方法，建立并優化了根結線蟲ISSR-PCR的體系。適用于南方根結線蟲的25 μL ISSR-PCR反應體系中各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黃瓜與番茄根部南方根結線蟲的ISSR-PCR鑒別

將取自黃瓜和番茄根部的南方根結線蟲采用ISSR-PCR分子標記，利用50個引物進行篩選。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

依據參考文獻[2]的方法，鑒別出所采黃瓜和番茄的根部樣本中的根結線蟲均為南方根結線蟲。同時前人的研究結果也顯示該地區的根結線蟲為南方根結線蟲。

2.2 ISSR-PCR擴增結果分析

由圖1 可知，以不同寄主上的南方根結線蟲DNA為模板，利用ISSR-PCR分子標記的方法，使用不同的引物對其進行擴增反應，結果顯示，雖然形態學上雌蟲的會陰花紋觀察發現寄生在黃瓜和番茄根部的根結線蟲均為南方根結線蟲，但是利用ISSR-RCR分子標記發現，南方根結線蟲在不同寄主上卻存在差異性。本試驗中篩選了50個引物，發現1個引物對不同寄主上的南方根結線蟲擴增后存在差異性。

2.3 鑒別結果

在篩選的50個ISSR引物中，其中有1個引物841擴增的結果顯示兩者之間存在差異性（圖2）。來自不同寄主的南方根結線蟲，其會陰花紋均具背弓較高的特點，但其DNA水平上卻存在差異。A泳道均為黃瓜根部的南方根結線蟲，B泳道均為番茄根部的南方根結線蟲，而引物841能將二者鑒別開來。

3 討論

一直以來，會陰花紋在鑒定根結線蟲的種的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究顯示，會陰花紋存在較大的變異性，而ISSR-PCR能夠幫助彌補會陰花紋變異所帶來的鑒定局限性。與此同時，南方根結線蟲具有4個生理小種，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小種。而本次試驗采集黃瓜和番茄根部樣品的季節不同，黃瓜是在冬季蔬菜溫棚中采集的根部樣本，而番茄卻是在7月份的露天大田里采集的根部樣本，所以，筆者推斷ISSR-PCR結果之所以有差異性，可能是不同的生理小種造成的。以往對南方根結線蟲生理小種的鑒別依據是鑒別寄主，本試驗結果提示以后可以考慮利用ISSR-PCR鑒別南方根結線蟲的生理小種；并且本試驗結果也可為今后寧夏地區根結線蟲病害的防治提供一定的理論依據。

參考文獻：

[1]黃 利，王 宇，董林林，等. 南方根結線蟲與秀麗線蟲同源基因的鑒定及其應用分析[J]. 中國農業大學學報，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金鈴，蔣 寒，孫龍華，等. 中國南方地區作物根結線蟲種和小種的鑒定[J]. 華中農業大學學報，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，張靠穩，孟北乾. 雌根結線蟲DNA的提取方法[J]. 江蘇農業科學，2013，41（6）：27-28.

摘要：以南方根結線蟲雌蟲DNA為基礎，通過ISSR-PCR分子標記鑒別出寄生在黃瓜和番茄上的南方根結線蟲。本試驗中ISSR-PCR反應體系25 μL，各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通過對50個ISSR引物的篩選，得到1個引物841，該引物能將寄生在不同寄主上的南方根結線蟲加以鑒別。

關鍵詞：南方根結線蟲；雌蟲；ISSR-PCR；鑒別；引物

中圖分類號： S432.4+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）是一種分布廣、危害嚴重的植物寄生線蟲[1]，通過其在侵染的寄主植物上的寄生行為直接引起作物的產量損失。傳統方法主要根據根結線蟲形態學進行鑒定和分類，但由于其較大的變異性導致有時結果不夠準確[2]。本試驗將南方根結線蟲形態學和 ISSR-PCR 分子標記的方法相結合，研究了賀蘭山軍馬場不同寄主上南方根結線蟲中種群的種類，為今后寧夏地區南方根結線蟲病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 南方根結線蟲樣本的采集

2012年1月在賀蘭山軍馬場溫棚采集有大量根結的黃瓜根部組織；2012年7月分別在賀蘭山軍馬場露天采集有大量根結的番茄根部組織。

1.2 南方根結線蟲的形態學鑒定

依據參考文獻[2]，分別觀察黃瓜和番茄根結中的根結線蟲雌蟲會陰花紋。

1.3 2種寄主根部南方根結線蟲DNA的提取

提取方法根據參考文獻[3]

1.4 2種不同寄主上南方根結線蟲的ISSR-PCR擴增

利用單因素試驗與正交設計試驗相結合的方法，建立并優化了根結線蟲ISSR-PCR的體系。適用于南方根結線蟲的25 μL ISSR-PCR反應體系中各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黃瓜與番茄根部南方根結線蟲的ISSR-PCR鑒別

將取自黃瓜和番茄根部的南方根結線蟲采用ISSR-PCR分子標記，利用50個引物進行篩選。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

依據參考文獻[2]的方法，鑒別出所采黃瓜和番茄的根部樣本中的根結線蟲均為南方根結線蟲。同時前人的研究結果也顯示該地區的根結線蟲為南方根結線蟲。

2.2 ISSR-PCR擴增結果分析

由圖1 可知，以不同寄主上的南方根結線蟲DNA為模板，利用ISSR-PCR分子標記的方法，使用不同的引物對其進行擴增反應，結果顯示，雖然形態學上雌蟲的會陰花紋觀察發現寄生在黃瓜和番茄根部的根結線蟲均為南方根結線蟲，但是利用ISSR-RCR分子標記發現，南方根結線蟲在不同寄主上卻存在差異性。本試驗中篩選了50個引物，發現1個引物對不同寄主上的南方根結線蟲擴增后存在差異性。

2.3 鑒別結果

在篩選的50個ISSR引物中，其中有1個引物841擴增的結果顯示兩者之間存在差異性（圖2）。來自不同寄主的南方根結線蟲，其會陰花紋均具背弓較高的特點，但其DNA水平上卻存在差異。A泳道均為黃瓜根部的南方根結線蟲，B泳道均為番茄根部的南方根結線蟲，而引物841能將二者鑒別開來。

3 討論

一直以來，會陰花紋在鑒定根結線蟲的種的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究顯示，會陰花紋存在較大的變異性，而ISSR-PCR能夠幫助彌補會陰花紋變異所帶來的鑒定局限性。與此同時，南方根結線蟲具有4個生理小種，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小種。而本次試驗采集黃瓜和番茄根部樣品的季節不同，黃瓜是在冬季蔬菜溫棚中采集的根部樣本，而番茄卻是在7月份的露天大田里采集的根部樣本，所以，筆者推斷ISSR-PCR結果之所以有差異性，可能是不同的生理小種造成的。以往對南方根結線蟲生理小種的鑒別依據是鑒別寄主，本試驗結果提示以后可以考慮利用ISSR-PCR鑒別南方根結線蟲的生理小種；并且本試驗結果也可為今后寧夏地區根結線蟲病害的防治提供一定的理論依據。

參考文獻：

[1]黃 利，王 宇，董林林，等. 南方根結線蟲與秀麗線蟲同源基因的鑒定及其應用分析[J]. 中國農業大學學報，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金鈴，蔣 寒，孫龍華，等. 中國南方地區作物根結線蟲種和小種的鑒定[J]. 華中農業大學學報，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，張靠穩，孟北乾. 雌根結線蟲DNA的提取方法[J]. 江蘇農業科學，2013，41（6）：27-28.

摘要：以南方根結線蟲雌蟲DNA為基礎，通過ISSR-PCR分子標記鑒別出寄生在黃瓜和番茄上的南方根結線蟲。本試驗中ISSR-PCR反應體系25 μL，各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通過對50個ISSR引物的篩選，得到1個引物841，該引物能將寄生在不同寄主上的南方根結線蟲加以鑒別。

關鍵詞：南方根結線蟲；雌蟲；ISSR-PCR；鑒別；引物

中圖分類號： S432.4+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）是一種分布廣、危害嚴重的植物寄生線蟲[1]，通過其在侵染的寄主植物上的寄生行為直接引起作物的產量損失。傳統方法主要根據根結線蟲形態學進行鑒定和分類，但由于其較大的變異性導致有時結果不夠準確[2]。本試驗將南方根結線蟲形態學和 ISSR-PCR 分子標記的方法相結合，研究了賀蘭山軍馬場不同寄主上南方根結線蟲中種群的種類，為今后寧夏地區南方根結線蟲病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 南方根結線蟲樣本的采集

2012年1月在賀蘭山軍馬場溫棚采集有大量根結的黃瓜根部組織；2012年7月分別在賀蘭山軍馬場露天采集有大量根結的番茄根部組織。

1.2 南方根結線蟲的形態學鑒定

依據參考文獻[2]，分別觀察黃瓜和番茄根結中的根結線蟲雌蟲會陰花紋。

1.3 2種寄主根部南方根結線蟲DNA的提取

提取方法根據參考文獻[3]

1.4 2種不同寄主上南方根結線蟲的ISSR-PCR擴增

利用單因素試驗與正交設計試驗相結合的方法，建立并優化了根結線蟲ISSR-PCR的體系。適用于南方根結線蟲的25 μL ISSR-PCR反應體系中各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黃瓜與番茄根部南方根結線蟲的ISSR-PCR鑒別

將取自黃瓜和番茄根部的南方根結線蟲采用ISSR-PCR分子標記，利用50個引物進行篩選。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

依據參考文獻[2]的方法，鑒別出所采黃瓜和番茄的根部樣本中的根結線蟲均為南方根結線蟲。同時前人的研究結果也顯示該地區的根結線蟲為南方根結線蟲。

2.2 ISSR-PCR擴增結果分析

由圖1 可知，以不同寄主上的南方根結線蟲DNA為模板，利用ISSR-PCR分子標記的方法，使用不同的引物對其進行擴增反應，結果顯示，雖然形態學上雌蟲的會陰花紋觀察發現寄生在黃瓜和番茄根部的根結線蟲均為南方根結線蟲，但是利用ISSR-RCR分子標記發現，南方根結線蟲在不同寄主上卻存在差異性。本試驗中篩選了50個引物，發現1個引物對不同寄主上的南方根結線蟲擴增后存在差異性。

2.3 鑒別結果

在篩選的50個ISSR引物中，其中有1個引物841擴增的結果顯示兩者之間存在差異性（圖2）。來自不同寄主的南方根結線蟲，其會陰花紋均具背弓較高的特點，但其DNA水平上卻存在差異。A泳道均為黃瓜根部的南方根結線蟲，B泳道均為番茄根部的南方根結線蟲，而引物841能將二者鑒別開來。

3 討論

一直以來，會陰花紋在鑒定根結線蟲的種的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究顯示，會陰花紋存在較大的變異性，而ISSR-PCR能夠幫助彌補會陰花紋變異所帶來的鑒定局限性。與此同時，南方根結線蟲具有4個生理小種，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小種。而本次試驗采集黃瓜和番茄根部樣品的季節不同，黃瓜是在冬季蔬菜溫棚中采集的根部樣本，而番茄卻是在7月份的露天大田里采集的根部樣本，所以，筆者推斷ISSR-PCR結果之所以有差異性，可能是不同的生理小種造成的。以往對南方根結線蟲生理小種的鑒別依據是鑒別寄主，本試驗結果提示以后可以考慮利用ISSR-PCR鑒別南方根結線蟲的生理小種；并且本試驗結果也可為今后寧夏地區根結線蟲病害的防治提供一定的理論依據。

參考文獻：

[1]黃 利，王 宇，董林林，等. 南方根結線蟲與秀麗線蟲同源基因的鑒定及其應用分析[J]. 中國農業大學學報，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金鈴，蔣 寒，孫龍華，等. 中國南方地區作物根結線蟲種和小種的鑒定[J]. 華中農業大學學報，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，張靠穩，孟北乾. 雌根結線蟲DNA的提取方法[J]. 江蘇農業科學，2013，41（6）：27-28.