不同基因型煙草葉片成熟過程中質體色素降解及相關酶活性變化

李麗華等

摘要：以不同煙草品種（系）云煙87、中煙100、豫煙10號、豫煙11號和8306中部葉片為材料，分析了煙葉成熟過程中質體色素降解和相關酶活性變化及其與烤后煙葉中性致香物質含量的關系。結果表明，在成熟過程中煙葉的質體色素含量呈下降趨勢，葉綠素的降解量總體大于類胡蘿卜素，且葉綠素a的降解量顯著高于葉綠素 b。中煙100前期葉綠素合成較多，降解也較為迅速，但成熟后期降解緩慢；豫煙11號成熟期質體色素降解量較大，質體色素降解產物較高。脂氧合酶活性在煙葉成熟過程中呈現先升后降的趨勢，且與類胡蘿卜素的降解量呈極顯著正相關。在不同煙草品種（系）間質體色素降解量及中性致香物質總量均表現為豫煙11號>豫煙10號>8306>中煙100>云煙87，品種間中性致香物質形成與質體色素的最大積累量無關，與質體色素的降解量有關，脂氧合酶活性較高、質體色素降解量大的品種（系）中性致香物質含量較高。

關鍵詞：煙草；基因型；質體色素；中性致香物質

中圖分類號：S572.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）03-0065-04

煙草質體色素主要包括葉綠素（chlorophyll，Chl）和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）[1]，主要存在于煙葉細胞的細胞器質體中，是煙草生長過程中光合作用的重要物質，對改善煙葉品質和提高煙葉工業可用性具有重要意義[2-3]。質體色素是煙葉重要的香氣前體物，其本身不具有香味特征，但通過分解、轉化可形成對煙葉香氣品質有重要貢獻的香氣成分[4]；煙葉質體色素的降解產物是所測定的中性致香物質中含量最高的，占中性致香物質總量的85%～96%[5]，其中類胡蘿卜素降解產物的含量占8%～12%，對煙葉香氣質量的影響較大[6]。不同基因型煙草質體色素的合成與降解量存在較大差異[7]。

前人研究認為，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）既是煙葉類胡蘿卜素降解的關鍵酶[8]，又與煙葉葉綠素降解有關[9]。煙葉類胡蘿卜素在LOX作用下氧化降解產生β-二氫大馬酮、巨豆三烯酮、β-紫羅蘭酮等致香物質[8]，LOX及其過氧化產物的氧化漂白作用使煙草葉綠素降解成新植二烯等致香物質[10]，但煙葉成熟過程中質體色素的降解及脂氧合酶的調控作用和與烤后煙中性致香物質含量的關系尚不明了。因此，本研究選取5個不同基因型煙草品種對煙葉成熟過程中質體色素含量、脂氧合酶活性變化及烤后煙葉中性致香物質含量進行分析，以揭示色素降解與煙葉香氣物質含量的關系，并探討煙葉成熟過程中脂氧合酶與質體色素降解的關系，為揭示濃香型特色優質煙葉形成機理和提高煙葉香氣物質含量提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2012—2013年在河南省許昌市進行，以云煙87、中煙100、豫煙10號、豫煙11號和8306（遺傳上穩定的品系）5個煙草品種作為參試材料。試驗采用單因子完全隨機區組設計，3次重復，每個小區種植面積330 m2，行株距為 120 cm×50 cm。5月2日移栽，按照大田優質煙葉生產管理方法管理。每個品種各選取整齊一致的單株，以第11張葉（自下向上數）為試驗對象，在葉齡40、50、60、70、80 d（以幼葉長 1 cm、寬0.5 cm時作為葉齡1 d）取樣測定質體色素（葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素）含量和脂氧合酶活性，各項指標測定重復3次。

采用三段式烘烤工藝進行調制，各基因型煙葉在統一的烘烤環境中烘烤，按 GB 2635—1992《烤煙》進行分級，初烤煙樣用于中性致香物質含量測定。

1.2 測定項目與方法

采用分光光度計法測定質體色素的含量[11]；脂氧合酶（LOX）活性參照文獻[12]的方法測定。

采用內標法測定煙葉中性致香物質香氣成分。中性致香物質提取及定性定量分析采用HP5890-5972氣質聯用儀。GC/MS分析條件如下：HP-5色譜柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm）；載氣He，流速0.8 mL/min；近樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度177 ℃；升溫程序：50 ℃保持 2 min 后，以2 ℃/min的速度升至120 ℃，5 min后再以 2 ℃/min 的速度升至240 ℃，保持30 min；分流比1 ∶ 15，進樣量2 μL；電離能70 eV；質量數范圍50～500 amu；MS譜庫為NIST02；采用內標法定量。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0數據處理系統和Microsoft Excel 2003軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型煙草葉片葉綠素含量的動態變化

由圖1、圖2可知，不同基因型煙草葉片中葉綠素的含量動態變化趨勢類似。葉綠素含量隨成熟期的推進而逐漸下降，但品種（系）間含量存在差異，云煙87葉綠素a含量在葉齡40～60 d變化平穩，葉齡60～80 d呈直線下降趨勢；豫煙11號、8306和豫煙10號較大幅度下降出現在葉齡50～60 d；葉綠素b在整個成熟過程中下降幅度小于葉綠素a，變化比較平緩。因此，在煙葉成熟期，葉綠素a和葉綠素b的比值雖大于1，但逐漸減小；同一葉齡不同基因型煙草葉片的葉綠素含量存在明顯差異，中煙100葉齡40 d時含量最大，而在葉齡 50 d 時含量偏低，葉齡80 d時含量仍然最高，表明中煙100前期葉綠素合成較多，其降解也較為迅速，但成熟后期降解緩慢；葉齡80 d時豫煙10號葉綠素含量最少，僅為 0.172 mg/g；豫煙10號葉綠素降解量最大，為1.904 mg/g，云煙87降解量最小，為0.989 mg/g。

2.2 不同基因型煙草葉片類胡蘿卜素含量的動態變化

由圖3可知，不同基因型煙草葉片在葉齡40 d時類胡蘿卜素含量均已達到最大值，隨著成熟期葉齡增加，類胡蘿卜素

含量呈現逐漸下降的趨勢。不同基因型煙草葉片類胡蘿卜素含量和變化動態有很大差異，中煙100在整個成熟過程中類胡蘿卜素含量均最高，說明中煙100在成熟過程中類胡蘿卜素降解較緩慢；除葉齡70～80 d時豫煙11號類胡蘿卜素含量最少外，云煙87在整個成熟過程中含量最低；豫煙11號在葉齡40～50 d降幅平穩，葉齡50～60 d處于大量降解時期；8306在葉齡60～70 d降幅最大。不同品種（系）生長成熟期間類胡蘿卜素降解量表現為豫煙11號>8306>豫煙10號>中煙100>云煙87，且豫煙11號煙葉葉齡80 d時類胡蘿卜素含量最低，降解最為充分。

2.3 不同基因型煙草葉片脂氧合酶活性的動態變化

LOX是一種含非血紅素鐵的蛋白質，它專一催化含有順，順-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸加氧反應，生成具有共軛雙鍵的過氧化氫物[13]。本試驗結果（圖4）表明，煙葉成熟過程中，脂氧合酶的活性呈現明顯的倒“V”形特征；不同基因型煙草葉片脂氧合酶活性和變化動態有很大差異，在葉齡40～50 d時酶活性變化較平穩，葉齡50～60 d時酶活性迅速攀升且60 d出現最大峰值，之后迅速下降，8306脂氧合酶在葉齡70 d時仍保持較高活性；豫煙11號葉齡40 d時脂氧合酶活性最低，為2.76 D234 nm/（g·min），葉齡60 d時達到各品種最大值15.4 D234 nm/（g·min），說明該時期豫煙11號煙葉代謝比較旺盛，8306在整個成熟過程中脂氧合酶活性均較高。

2.4 不同基因型煙草葉片成熟過程中質體色素與酶活性的相關分析

不同品種（系）煙草葉片在成熟過程中葉齡間質體色素降解量與相同葉齡內脂氧合酶活性的相關分析結果表明，在整個生育期內脂氧合酶活性與類胡蘿卜素降解量和總質體色素降解量均呈極顯著（P<0.01）正相關，相關系數分別為 0.661* *、0.663* *，LOX對類胡蘿卜素的降解起著至關重要的作用；脂氧合酶活性與葉綠素a和葉綠素b的降解量呈正相關，但未達顯著水平（相關系數0.404、0.203）（表1），因此LOX的作用對不同品種（系）煙草葉片成熟過程中葉綠素的降解很重要，但LOX可能不是葉綠素降解唯一的關鍵酶。

利用GS/MS方法從烤后煙葉中分離鑒定出15種類胡蘿卜素降解產物，主要有β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內酯、巨豆三烯酮等，在15 種類胡蘿卜素降解產物中，以 β-大馬酮的含量最高。不同基因型煙草葉片中所含類胡蘿卜素降解產物的種類相同，但各品種（系）類胡蘿卜素降解產物含量卻有所差異，各處理類胡蘿卜素降解產物的總量大小順序為豫煙11號>豫煙10號>云煙87>8306>中煙100，且 豫煙11號是中煙100的1.40倍。香氣物質總量與新植二烯含量順序相同，為豫煙11號>豫煙10號>8306>中煙100>云煙87。

3 結論與討論

質體色素（葉綠素和類胡蘿卜素）是影響煙葉品質和可用性的主要成分之一，它不僅決定了調制后煙葉的色澤，而且其相關降解產物與煙葉的香氣質和香氣量密切相關。因此，煙草生長成熟期和調制后質體色素的含量變化，將直接影響到煙葉制品的香氣風格和工業可用性；深入研究不同基因型煙葉中質體色素的形成、轉化和降解規律，闡明其降解產物與烤煙香氣風格的形成關系，對提高煙葉香氣質和香氣量的煙草品種篩選與評價具有重要意義。

類胡蘿卜素降解產物是構成煙葉香氣質量的重要組分。許多類胡蘿卜素降解產物已是烤煙中確定的重要香氣成分，它們產生香味的閾值相對較低，刺激性較小，香氣質較好，對煙氣香氣貢獻率大[15]，是形成烤煙細膩、高雅、清新香氣的主要成分。韋鳳杰等研究表明不同基因型煙葉質體色素含量隨成熟進程的推進而逐漸下降[16]。本試驗結果不同質體色素變化規律與其基本相同，但降解量有明顯差異，葉綠素a的降解量大于葉綠素b，類胡蘿卜素降低幅度總體小于葉綠素；不同基因型煙葉質體色素及其降解產物含量有一定的差異，豫煙11號成熟期質體色素降解量較大，質體色素降解產物較多，中煙100生長過程中質體色素合成雖然最多，但成熟和調制過程中沒有充分降解，其質體色素降解產物最少，因為栽培措施和生長條件一致，所以質體色素的差異是由基因型決定的；不同基因型煙葉質體色素及其降解產物含量的差異也可能是導致不同煙草品種表現出不同的香味質量和風格的重要原因。

在煙葉烘烤中，LOX既是類胡蘿卜素降解的關鍵酶[17-18]，又和葉綠素降解密切相關[19]，對烤煙的香氣質和量有重要影響[10]。對于不同品種（系）煙草，LOX活性在煙葉生長成熟過程中均呈現先升后降的趨勢，LOX活性與類胡蘿卜素的降解量呈極顯著正相關，這與文獻[20-21]報道的類胡蘿卜素降解與LOX活性呈顯著正相關的結論完全一致，也與文獻[17]等報道的LOX與烤煙類胡蘿卜素降解呈高度正相關的結論相符；脂氧合酶活性與葉綠素a和葉綠素b的降解量的相關性沒有達到顯著水平（P>0.05），這與文獻[22]報道煙葉烘烤中LOX活性與葉綠素降解速率均呈顯著正相關的結論不完全一致，但與文獻[23]結論一致，可能是LOX活性與葉綠素降解的相關特征與煙草品種、溫度、成熟度[14]等多種因素有關，需要作進一步研究。因此，在煙葉成熟過程中，LOX對類胡蘿卜素的降解起著至關重要的作用，但可能不是葉綠素降解的關鍵酶。對于不同基因型煙草葉片在成熟過程中的質體色素降解，LOX可能主要作用于類胡蘿卜素而不是葉綠素。

品種間中性致香物質形成與質體色素的最大積累量無關，而與其質體色素的降解量有關，質體色素降解量大的品種（系）中性致香物質含量較高。在煙葉生長過程中，促進質體色素的積累，而在成熟和調制過程中促進煙葉質體色素的充分降解，提高色素降解量，將有利于促進煙葉香氣物質的形成，提高煙葉的香氣品質。

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