引進的俄羅斯高效大豆根瘤菌培養基的選擇與優化

趙念力等

摘要：將引進的俄羅斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5種培養基中進行培養，相關生長情況的試驗結果表明，該菌株在YMA培養基中生長較快。在YMA培養基中進行的碳源利用試驗表明，在葡萄糖為碳源的培養基中根瘤菌生長得最好。按L9（34）正交設計表對YMA培養基中的4個組分比例進行優化，對結果進行分析可得最優的培養基配方（1 L）為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去離子水補足至1 000 mL。

關鍵詞：俄羅斯大豆根瘤菌；培養基；優化

中圖分類號： Q93-335 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌與豆科植物能形成共生的固氮體系，在自然界中，這個體系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌與大豆共生可以形成根瘤，能將空氣中的氮固定轉化成為大豆可以直接吸收利用的銨。大豆與根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素營養狀況、提高大豆的產量和品質，又能將更多的固定氮素釋放到土壤中，從而起到培肥地力的作用[2]。目前，接種根瘤菌劑已經成為世界各國豆科作物增產、減少化肥施用的一項技術措施，在許多國家都有大規模商品菌劑的生產和出售，應用面積也不斷擴大。隨著無公害農業的發展，接種高效大豆根瘤菌將產生更顯著的社會與環境效益[3]。俄羅斯對根瘤菌的研究已有近百年的歷史，具有了一定的理論基礎并積累了豐富的實踐經驗[4-5]。2009年黑龍江省農業科學院從全俄大豆科學研究所引進了十多個高效大豆固氮根瘤菌株，并結合黑龍江省的生態環境特點和大豆主栽品種進行綜合研究、開發和應用。大豆根瘤菌通常選用YMA培養基進行分離培養，但其生長較慢，不適合在生產上加以應用，因此有必要研究、改良培養基配方，選擇最適合俄羅斯大豆根瘤菌生長的培養基配方，提高大豆根瘤菌的培養速度。本研究主要通過優化俄羅斯高效大豆根瘤菌培養基，篩選出最適合根瘤菌生長的培養基配方，為實現高密度發酵培養提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株為引進的俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株，為大豆快生根瘤菌，由俄羅斯全俄大豆科學研究所提供。

1.2 培養基

試驗用培養基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5種，配方如下。（1）YMA培養基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（將5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調節pH值6.8～7.0。（2）SM培養基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合維生素液（將10 mg硫胺、10 mg煙酰胺、10 mg泛酸鈣、1 mg生物素溶解于100 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調節pH值6.8～7.0。（3）TY培養基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去離子水至1 000 mL，調節pH值為7.0。（4）PA培養基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去離子水至1 000 mL，調節pH值 6.8～7.0。（5）BSE培養基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去離子水至1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 根瘤菌菌種的活化、傳代、接種 將根瘤菌在斜面培養基上28 ℃的條件下培養2 d后接種到YMA培養液中，再置于28 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養4 d，制成接種液。

1.3.2 根瘤菌的培養 將培養好的接種液按照體積比1%的接種量接入5種液體培養基中，250 mL三角瓶的裝液量為100 mL，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養。

1.3.3 培養基的比較 在600 nm下測定不同培養時間的吸光度，繪制大豆根瘤菌在5種培養基中的生長曲線。

1.3.4 不同碳源的篩選試驗 在培養基選擇試驗的基礎上，進一步在生長較好的培養基上進行碳源的篩選試驗。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖替換YMA培養基中的甘露醇，同時保持其他成分不變。接種根瘤菌于液體培養基上，接種量為1%，于28 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養，分別在培養12、24、36、48h時測定D600 nm。

1.3.5 培養基的優化 在常規培養基的基礎上對大豆根瘤菌的培養基進行進一步優化。進行碳源篩選之后，采用L9（34） 正交設計方案對培養基的主要營養成分進行優化，正交設計見表1。

3 結論

通過對5種培養基的篩選表明，YMA培養基較適于俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株的生長。碳源利用試驗表明，葡萄糖為最優碳源。正交試驗得到GF菌株的最優培養基配方為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水補至1 000 mL。優化的根瘤菌YMA培養基在避免資源浪費和降低生產成本的前提下，實現了根瘤菌的大量、快速生長，為根瘤菌工業生產奠定了基礎[6]。

參考文獻：

[1]劉保平，周俊初. 根瘤菌菌劑研究[J]. 湖北農業科學，2006，45（1）：57-61.

[2]譚 娟. 接種俄羅斯大豆根瘤菌對大豆生長和產量的影響[J]. 作物雜志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持續發展農業中的應用[M]. 北京：中國科技出版社，1994.

[4]張 武. 俄羅斯大豆根瘤菌與不同大豆品種的生態適應性[J]. 作物雜志，2010（3）：54-55.

[5]李艷杰. 接種大豆根瘤菌對大豆生長及產量的影響[J]. 黑龍江農業科學，2013（1）：50-53.

[6]吳紅慧，周俊初. 根瘤菌培養基的優化和劑型的比較研究[J]. 微生物學通報，2004，31（2）：14-19.

摘要：將引進的俄羅斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5種培養基中進行培養，相關生長情況的試驗結果表明，該菌株在YMA培養基中生長較快。在YMA培養基中進行的碳源利用試驗表明，在葡萄糖為碳源的培養基中根瘤菌生長得最好。按L9（34）正交設計表對YMA培養基中的4個組分比例進行優化，對結果進行分析可得最優的培養基配方（1 L）為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去離子水補足至1 000 mL。

關鍵詞：俄羅斯大豆根瘤菌；培養基；優化

中圖分類號： Q93-335 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌與豆科植物能形成共生的固氮體系，在自然界中，這個體系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌與大豆共生可以形成根瘤，能將空氣中的氮固定轉化成為大豆可以直接吸收利用的銨。大豆與根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素營養狀況、提高大豆的產量和品質，又能將更多的固定氮素釋放到土壤中，從而起到培肥地力的作用[2]。目前，接種根瘤菌劑已經成為世界各國豆科作物增產、減少化肥施用的一項技術措施，在許多國家都有大規模商品菌劑的生產和出售，應用面積也不斷擴大。隨著無公害農業的發展，接種高效大豆根瘤菌將產生更顯著的社會與環境效益[3]。俄羅斯對根瘤菌的研究已有近百年的歷史，具有了一定的理論基礎并積累了豐富的實踐經驗[4-5]。2009年黑龍江省農業科學院從全俄大豆科學研究所引進了十多個高效大豆固氮根瘤菌株，并結合黑龍江省的生態環境特點和大豆主栽品種進行綜合研究、開發和應用。大豆根瘤菌通常選用YMA培養基進行分離培養，但其生長較慢，不適合在生產上加以應用，因此有必要研究、改良培養基配方，選擇最適合俄羅斯大豆根瘤菌生長的培養基配方，提高大豆根瘤菌的培養速度。本研究主要通過優化俄羅斯高效大豆根瘤菌培養基，篩選出最適合根瘤菌生長的培養基配方，為實現高密度發酵培養提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株為引進的俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株，為大豆快生根瘤菌，由俄羅斯全俄大豆科學研究所提供。

1.2 培養基

試驗用培養基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5種，配方如下。（1）YMA培養基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（將5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調節pH值6.8～7.0。（2）SM培養基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合維生素液（將10 mg硫胺、10 mg煙酰胺、10 mg泛酸鈣、1 mg生物素溶解于100 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調節pH值6.8～7.0。（3）TY培養基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去離子水至1 000 mL，調節pH值為7.0。（4）PA培養基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去離子水至1 000 mL，調節pH值 6.8～7.0。（5）BSE培養基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去離子水至1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 根瘤菌菌種的活化、傳代、接種 將根瘤菌在斜面培養基上28 ℃的條件下培養2 d后接種到YMA培養液中，再置于28 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養4 d，制成接種液。

1.3.2 根瘤菌的培養 將培養好的接種液按照體積比1%的接種量接入5種液體培養基中，250 mL三角瓶的裝液量為100 mL，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養。

1.3.3 培養基的比較 在600 nm下測定不同培養時間的吸光度，繪制大豆根瘤菌在5種培養基中的生長曲線。

1.3.4 不同碳源的篩選試驗 在培養基選擇試驗的基礎上，進一步在生長較好的培養基上進行碳源的篩選試驗。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖替換YMA培養基中的甘露醇，同時保持其他成分不變。接種根瘤菌于液體培養基上，接種量為1%，于28 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養，分別在培養12、24、36、48h時測定D600 nm。

1.3.5 培養基的優化 在常規培養基的基礎上對大豆根瘤菌的培養基進行進一步優化。進行碳源篩選之后，采用L9（34） 正交設計方案對培養基的主要營養成分進行優化，正交設計見表1。

3 結論

通過對5種培養基的篩選表明，YMA培養基較適于俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株的生長。碳源利用試驗表明，葡萄糖為最優碳源。正交試驗得到GF菌株的最優培養基配方為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水補至1 000 mL。優化的根瘤菌YMA培養基在避免資源浪費和降低生產成本的前提下，實現了根瘤菌的大量、快速生長，為根瘤菌工業生產奠定了基礎[6]。

參考文獻：

[1]劉保平，周俊初. 根瘤菌菌劑研究[J]. 湖北農業科學，2006，45（1）：57-61.

[2]譚 娟. 接種俄羅斯大豆根瘤菌對大豆生長和產量的影響[J]. 作物雜志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持續發展農業中的應用[M]. 北京：中國科技出版社，1994.

[4]張 武. 俄羅斯大豆根瘤菌與不同大豆品種的生態適應性[J]. 作物雜志，2010（3）：54-55.

[5]李艷杰. 接種大豆根瘤菌對大豆生長及產量的影響[J]. 黑龍江農業科學，2013（1）：50-53.

[6]吳紅慧，周俊初. 根瘤菌培養基的優化和劑型的比較研究[J]. 微生物學通報，2004，31（2）：14-19.

摘要：將引進的俄羅斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5種培養基中進行培養，相關生長情況的試驗結果表明，該菌株在YMA培養基中生長較快。在YMA培養基中進行的碳源利用試驗表明，在葡萄糖為碳源的培養基中根瘤菌生長得最好。按L9（34）正交設計表對YMA培養基中的4個組分比例進行優化，對結果進行分析可得最優的培養基配方（1 L）為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去離子水補足至1 000 mL。

關鍵詞：俄羅斯大豆根瘤菌；培養基；優化

中圖分類號： Q93-335 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌與豆科植物能形成共生的固氮體系，在自然界中，這個體系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌與大豆共生可以形成根瘤，能將空氣中的氮固定轉化成為大豆可以直接吸收利用的銨。大豆與根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素營養狀況、提高大豆的產量和品質，又能將更多的固定氮素釋放到土壤中，從而起到培肥地力的作用[2]。目前，接種根瘤菌劑已經成為世界各國豆科作物增產、減少化肥施用的一項技術措施，在許多國家都有大規模商品菌劑的生產和出售，應用面積也不斷擴大。隨著無公害農業的發展，接種高效大豆根瘤菌將產生更顯著的社會與環境效益[3]。俄羅斯對根瘤菌的研究已有近百年的歷史，具有了一定的理論基礎并積累了豐富的實踐經驗[4-5]。2009年黑龍江省農業科學院從全俄大豆科學研究所引進了十多個高效大豆固氮根瘤菌株，并結合黑龍江省的生態環境特點和大豆主栽品種進行綜合研究、開發和應用。大豆根瘤菌通常選用YMA培養基進行分離培養，但其生長較慢，不適合在生產上加以應用，因此有必要研究、改良培養基配方，選擇最適合俄羅斯大豆根瘤菌生長的培養基配方，提高大豆根瘤菌的培養速度。本研究主要通過優化俄羅斯高效大豆根瘤菌培養基，篩選出最適合根瘤菌生長的培養基配方，為實現高密度發酵培養提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株為引進的俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株，為大豆快生根瘤菌，由俄羅斯全俄大豆科學研究所提供。

1.2 培養基

試驗用培養基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5種，配方如下。（1）YMA培養基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（將5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調節pH值6.8～7.0。（2）SM培養基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合維生素液（將10 mg硫胺、10 mg煙酰胺、10 mg泛酸鈣、1 mg生物素溶解于100 mL去離子水中制成），加去離子水至1 000 mL，調節pH值6.8～7.0。（3）TY培養基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去離子水至1 000 mL，調節pH值為7.0。（4）PA培養基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去離子水至1 000 mL，調節pH值 6.8～7.0。（5）BSE培養基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去離子水至1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 根瘤菌菌種的活化、傳代、接種 將根瘤菌在斜面培養基上28 ℃的條件下培養2 d后接種到YMA培養液中，再置于28 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養4 d，制成接種液。

1.3.2 根瘤菌的培養 將培養好的接種液按照體積比1%的接種量接入5種液體培養基中，250 mL三角瓶的裝液量為100 mL，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養。

1.3.3 培養基的比較 在600 nm下測定不同培養時間的吸光度，繪制大豆根瘤菌在5種培養基中的生長曲線。

1.3.4 不同碳源的篩選試驗 在培養基選擇試驗的基礎上，進一步在生長較好的培養基上進行碳源的篩選試驗。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖替換YMA培養基中的甘露醇，同時保持其他成分不變。接種根瘤菌于液體培養基上，接種量為1%，于28 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養，分別在培養12、24、36、48h時測定D600 nm。

1.3.5 培養基的優化 在常規培養基的基礎上對大豆根瘤菌的培養基進行進一步優化。進行碳源篩選之后，采用L9（34） 正交設計方案對培養基的主要營養成分進行優化，正交設計見表1。

3 結論

通過對5種培養基的篩選表明，YMA培養基較適于俄羅斯大豆根瘤菌GF菌株的生長。碳源利用試驗表明，葡萄糖為最優碳源。正交試驗得到GF菌株的最優培養基配方為：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水補至1 000 mL。優化的根瘤菌YMA培養基在避免資源浪費和降低生產成本的前提下，實現了根瘤菌的大量、快速生長，為根瘤菌工業生產奠定了基礎[6]。

參考文獻：

[1]劉保平，周俊初. 根瘤菌菌劑研究[J]. 湖北農業科學，2006，45（1）：57-61.

[2]譚 娟. 接種俄羅斯大豆根瘤菌對大豆生長和產量的影響[J]. 作物雜志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持續發展農業中的應用[M]. 北京：中國科技出版社，1994.

[4]張 武. 俄羅斯大豆根瘤菌與不同大豆品種的生態適應性[J]. 作物雜志，2010（3）：54-55.

[5]李艷杰. 接種大豆根瘤菌對大豆生長及產量的影響[J]. 黑龍江農業科學，2013（1）：50-53.

[6]吳紅慧，周俊初. 根瘤菌培養基的優化和劑型的比較研究[J]. 微生物學通報，2004，31（2）：14-19.