乙蒜素與溴硝醇、代森錳鋅2種農藥復配對丁香假單胞桿菌的聯合毒力

王瑞等

摘要：為篩選防治獼猴桃潰瘍病的有效藥劑，采用抑菌圈法，測定乙蒜素分別與溴硝醇、代森錳鋅 2 種藥劑復配對丁香假單胞桿菌的聯合毒力，并篩選出最佳組配。結果表明，乙蒜素與溴硝醇以 1 ∶ 5 的比例復配增效作用最好，EC50為0.001 mg/mL，共毒系數為214.7，低于農用鏈霉素（EC50為0.004 mg/mL）；乙蒜素與與代森錳鋅以1 ∶ 3復配時也具有增效作用，EC50為0.005 mg/mL，共毒系數為205.7。

關鍵詞：乙蒜素；溴硝醇；代森錳鋅；丁香假單胞桿菌；復配；增效作用

中圖分類號： S481+.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0071-03

由丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae pv. actinidia）引起的獼猴桃潰瘍病是一種毀滅性的細菌性病害。近年來，該病害來勢兇猛、危害猖獗，常造成獼猴桃果園毀滅，給獼猴桃產業造成極大的損失。2010年以來，中國、法國、新西蘭、西班牙、土耳其、韓國、意大利等國家種植獼猴桃相繼大規模暴發潰瘍病，并確認致病菌為丁香假單胞桿菌[1-7]。貴州省修文縣自2008年以來大力發展獼猴桃種植業，2011年該縣獼猴桃被國家工商總局核準為地理標志證明商標；預計到2015年，全縣獼猴桃面積計劃發展到2 000 hm2，產量3萬t以上。該病害在修文縣也存在暴發趨勢，嚴重影響了該地區獼猴桃產業健康發展[8]。目前，國內外研究者對獼猴桃潰瘍病的防治主要集中于農業防治、化學防治和生物防治3個方面，其中最有效的方法為化學防治。但國內外對于該病害的藥劑防治主要依賴于銅制劑和鏈霉素，這些藥劑長期使用和不規范使用易使病原菌產生抗藥性，導致防治效果下降[9]?；瘜W藥劑的合理復配使用不僅可以起到提高防效、擴大防治譜的效果，還可達到有效延緩病原菌抗藥性和降低成本的目的[10]。筆者所在課題組在前期商品藥劑篩選工作中發現，乙蒜素、溴硝醇、代森錳鋅3種農藥在室內毒力和田間防治中效果較好。乙蒜素是一種高效、低毒、低殘留的有機硫廣譜內吸性殺菌劑，是中國首創的具有仿生結構的綠色農藥，對水稻、黃瓜、棉花、油菜等作物的稻瘟病、枯萎病、霜霉病、角斑病等病害防治效果良好，且殘留量低[10-11]。溴硝醇是一種溴代硝基醇類廣譜殺菌劑，具有很高的殺菌活性、很低的使用濃度以及較寬的pH值使用范圍，是美國食品藥物管理局（FDA）批準使用的化妝品防腐劑之一，在農業生產中也得到廣泛使用[12]。與上述2種農藥相似，代森錳鋅也為一種廣譜、低毒、低殘留、高效、不易產生抗性的保護性殺菌劑，并已用于獼猴桃潰瘍病的防治[13]。本研究在前期工作的基礎上，將修文縣境內獼猴桃植株患處分離、純化并經菌落PCR、DNA測序和比對，得到潰瘍病致病菌丁香假單胞桿菌。以此為靶標，測定乙蒜素、溴硝醇和代森錳鋅單劑和不同比例復配藥劑室內毒力，從而篩選出最佳活性的組配，為獼猴桃種植業中潰瘍病的繁殖提供長效、高效藥劑。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試藥劑包括80%代森錳鋅可濕性粉劑（美國陶氏益農公司）；30%乙蒜素乳油（浙江平湖農藥廠）；20%溴硝醇可濕性粉劑（遼寧省丹東市農藥總廠）。對照藥劑為72%硫酸鏈霉素（四川普惠生物工程有限公司）。

1.2 供試菌種

參照方中達的方法[14]，于2012年3月從貴州省貴陽市修文益眾農場發病植株患處取樣；通過選擇性培養、分離、純化、保存；使用16S rRNA進行菌落PCR，得到16S rRNA序列，通過在美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因庫Blast比對，獲得高同源性序列，根據搜索的高同源性序列可知目標菌種屬于丁香假單胞桿菌屬，從而得到靶標。

1.3 供試培養基

NA培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，經蒸餾水定容至1 000 mL，pH值調為 6.8～7.0，121 ℃濕熱滅菌20 min備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 藥劑處理 乙蒜素、溴硝醇、代森錳鋅、乙蒜素 ∶ 溴硝醇（1 ∶ 5、1 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1）以及乙蒜素 ∶ 代森錳鋅（1 ∶ 5、1 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1）。單劑和復配制劑均設為125、0.625、0.4167、0.3125、0.25、0.2083 mg/mL 等6個濃度梯度，每個濃度設3個平行，另設清水為空白對照，農用鏈霉素為對照。

1.4.2 測定方法 采用抑菌圈法測定單劑、復配劑對丁香假單胞桿菌的室內毒力。用無菌水配置含病原菌細胞100萬～1 000萬/mL 的菌懸液，每皿加入菌懸液1.5 mL，倒入約 12 mL 冷卻的NA培養基，搖勻后制成平板。將直徑為6 mm的消毒濾紙片放入各藥液內浸泡1 h，取出，放入平皿中，以無菌水浸泡濾紙為對照（CK），置于28 ℃下培養，每處理重復3次。48 h后觀察，測量抑菌圈直徑，計算抑制率[15]，將抑制率換算成抑制概率，以藥劑濃度為橫坐標、以抑制概率為縱坐標作回歸直線，得到各藥劑對獼猴桃潰瘍致病菌的毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。

3 結論

在前期大量藥劑篩選過程中發現，乙蒜素、代森錳鋅和溴硝醇對修文地區獼猴桃潰瘍病致病菌具有較高的生物活性。本研究從該地區因長期使用農用鏈霉素而產生抗性問題、增加防控藥劑的角度出發，將乙蒜素、代森錳鋅、溴硝醇進行復配，以農用鏈霉素為對照進行室內生物活性篩選，結果表明，乙蒜素與代森錳鋅配比為 1 ∶ 3、乙蒜素與溴硝醇配比為1 ∶ 5對引起獼猴桃潰瘍病的假單胞桿菌具有較好的生物活性，其EC50分別為0.005、0.001 mg/L，這2種復配劑共毒系數分別為205.7、214.7，所得結果經Wadley法[17]進一步驗證，表現出了明顯的增效作用；而農用鏈霉素的EC50為 0.004 mg/mL。從室內活性篩選的結果可知，篩選出的復配劑對假單胞桿菌具有優異的效果，有望代替硫酸鏈霉素對獼猴桃潰瘍病的防治。本研究為獼猴桃潰瘍病的田間防治奠定了良好的基礎，可為獼猴桃潰瘍病的大田防治提供參考，進一步的田間試驗正在進行中。

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