鏈霉菌防治植物病害的研究進展

易龍等

摘要：鏈霉菌是一種生防菌，可用于防治多種植物病害。本文介紹了鏈霉菌分類、對植物病害的生防機制，重點討論了鏈霉菌提高防治植物病害的途徑，提出了鏈霉菌應用研究中存在的主要問題，并對其進行了展望。

關鍵詞：鏈霉菌；生物防治；植物病害；生防機制；研究進展

中圖分類號： S476.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0091-04

20世紀50年代以來，化學農藥在糧食生產中起著舉足輕重的作用，然而化學農藥的廣泛應用，造成了環境污染、農藥殘留、破壞生態平衡及病菌產生抗藥性等問題。這促使各國政府、企業從過去單一開發化學農藥，轉而投入大量的人力、財力和物力開發生物農藥。近年來，越來越多的生物農藥商品化，開發對人類以及環境友好的、防治效果良好的、新的植物病蟲害生物防治方法一直是各國科學家研究的熱門領域[1]。鏈霉菌（Streptomyces）是高等放線菌，可產生多種抗生素、植物激素等活性物質，對提高植物的抗病、抗逆性能具有重要的作用，具有開發生物農藥的潛力[2-3]。國內外對鏈霉菌防治植物病害鮮見綜述報道，本文對國內外的鏈霉菌防治植物病害的相關研究進行了綜述，并對其發展前景進行了展望，以期進一步發揮鏈霉菌的生防作用，實現其代謝活性物質的高產量、工業化及開發低毒、高活性的新型物質，使其更好地為農業服務。

1 鏈霉菌的分類

長期以來，鏈霉菌缺少統一的分類標準，直到1943年Waksman等才首次建立了鏈霉菌屬[4]。1962年，鏈霉菌數值分類方法得到應用，Kmpfer等用數值分類法測定了鏈霉菌屬和鏈輪絲菌屬821個菌株的329個特征[5]。但后來發現鏈霉菌種的數量太大，而化學分類比數值分類更適合分析大量菌株，并有極高的可重復性。Manchester等通過全細胞蛋白SDS-PAGE圖譜分析，快速、準確地對大量鏈霉菌菌株進行了分類[6]。20世紀80年代，隨著核酸測序技術的發展，系統發育樹成為研究鏈霉菌分類地位最有效的方法。近年報道的鏈霉菌新種多是由16S rRNA序列分析確定的。Slim等基于16S rRNA基因的核苷酸序列，將TN17的放線菌確定為典型的鏈霉菌[7]。目前，鏈霉菌分類學研究發展為多相分類，即綜合考慮傳統的表型分類（形態和生理生化特征）、數值分類、化學分類和分子分類等各種信息，以確定菌株的分類地位。文才藝等通過確定形態特征、生理生化特性、細胞壁組分和16S rRNA基因序列的序列綜合分析，將分離的放線菌SCY311確定為圓突起鏈霉菌[8]。但我國國內與國際研究仍存在差距，不僅使發表的新種得不到國際承認，而且加大了開發以及利用鏈霉菌資源的難度。鏈霉菌是一個高度分化的菌屬，不同菌種之間有很大的差異，因此研究鏈霉菌的分類，建立快速、準確的鏈霉菌鑒定方法是目前我國鏈霉菌研究的重要課題，也是研究鏈霉菌防治植物病害的前提。

2 鏈霉菌生防機制

關于鏈霉菌的生防作用機制，國內外學者進行了大量研究。鏈霉菌對植物病害的生防作用機制包括拮抗作用、競爭作用和誘導植物抗性作用等方面，其生防效果往往不是單方面的，而是以上幾種方式作用的綜合結果，不同生防機制之間往往存在著協同作用。

2.1 拮抗

拮抗作用是微生物界的普遍現象。鏈霉菌能利用拮抗作用抑制其他植物病原微生物，即通過鏈霉菌次生代謝產物以及新的生物活性達到防治植物病害的目的[9-10]。申屠旭萍等報道了豐加霉素對水稻紋枯病菌、葡萄炭疽病菌和番茄灰霉病菌等7種植物病原真菌有很好的拮抗作用[11]。Harikrishnan等從土壤中分離的鏈霉菌VSMGT1014乙酸乙酯提取物有明顯抑制真菌菌絲生長、孢子和菌核萌發的作用[12]。Oskay研究了鏈霉KEH23菌株，發現其對人類致病細菌有抗菌活性，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌，且該菌可作為植物和人類的病原體生物防治劑[13]。Jayakumar等認為，阿維鏈霉菌發酵液對根結線蟲、南方根結線蟲和腎形線蟲有拮抗作用[14-15]。鏈霉菌可在代謝過程中產生抗生素和酶類等活性物質，來拮抗病原菌的生長、繁殖和侵染。

2.1.1 抗生素 鏈霉菌可通過產生抗生素來發揮拮抗作用。據統計，鏈霉菌產生的抗生素約為微生物產生的抗生素總量的90%[16]。作為生物農藥的一個重要分支，農用抗生素因具有高效、無殘留、易分解、與環境相容等優點而日益受到重視。細黃鏈霉菌（S. microflavus）產生的大環二酯類抗病毒抗生素Fattiviracins，對多種有包膜的DNA和RNA病毒有活性[17]。對鏈霉菌抗生素的研究很多，其他不再一一列舉（表1）。

2.1.2 酶類 鏈霉菌通過產生各種酶類抑制、降解、水解其他病原體，也是表現在防治植物病害上的一種途徑。萬平平等篩選出產β-1，3-葡聚糖酶的鏈霉菌，證明該酶對小麥紋枯病菌抑制作用很強，盆栽防病試驗表明，小麥的種子通過酶液處理后，防病效果為64.28%[36]。Morita等提純了作用于細胞壁肽聚糖的溶菌酶，該溶菌酶可以破壞細胞壁使微生物裂解死亡，而且對人和動植物沒有明顯毒性，安全可靠[37]。鏈霉菌WYEC108分泌的幾丁質酶，可通過催化幾丁質的水解破壞植物病原真菌細胞壁的主要成分，從而具有抑制植物病害發展的作用[38-39]。Singh等從鏈霉菌A6純化得到抗真菌絲氨酸蛋白酶[40]。Bielen等研究了天藍色鏈霉菌產生可作為生物催化劑的酯酶[41]。

2.2 競爭

目前研究的生防菌多數具有與病原菌的競爭作用，這也是生防微生物發揮作用的主要機制之一。競爭作用包括營養競爭和空間競爭。空間競爭是生防菌對植物表面空間或內部空間尤其是病原菌侵入位點的爭奪，生防菌預先定殖在植物表面阻止病原菌的直接侵入。鏈霉菌可以通過快速生長和繁殖而奪取養分和水分、占有空間、消耗氧氣等，以致削弱和排除同一生存環境中的某些病原物。鏈霉菌對生存空間和營養資源的競爭作用特別強，可以利用這一特點來排斥病原菌。endprint

2.3 誘導植物抗性作用

在關注生防菌與致病菌之間相互作用的同時，也不能忽略其對寄主植株的作用，很多微生物可以誘導寄主植物產生防御反應，使得局部或系統獲得抗性。張穗發現，吸水鏈霉菌可使水稻葉片中的過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性增強，誘導植株產生抗性防衛反應，具有激發水稻抗性防衛反應表達的特性[42]。鏈霉菌組成型表達載體pIB139攜帶的紅霉素強啟動子與目的基因的優化及生物合成，可以直接與植物相互作用，誘導植物抗性，與抗生素協同抗病[43]。

3 提高鏈霉菌防治植物病害效果的途徑

由于鏈霉菌防治植物病害時存在防治效果難以穩定、持久等缺點，尋找提高鏈霉菌防治植物病害效果的途徑顯得十分重要。提高鏈霉菌防治植物病害效果的途徑有誘變育種、固定化技術和改良發酵工藝等，其目標是為了提高目標產物的產量和純度，減少副產物，改變生物合成途徑，以獲得高產的新產品。人們經常通過種內融合或者紫外誘變等方式提高鏈霉菌分泌抗生素的能力，以提高其抑菌能力[44-45]。

3.1 誘變育種

人工誘變能提高突變頻率和擴大變異譜，具有速度快、方法簡便等優點，是當前菌種選育的一種方法。我國在利用太空輻射誘變對尼可霉素產生菌圈狀鏈霉菌的影響時發現，其主要生物活性組分X和Z的含量均有所提高[46]。車洪杰采用紫外線誘變和氯化鋰加紫外線復合誘變的方法對普特拉鏈霉菌F-1進行誘變改良，增強了其防病效果，降低了抗真菌物質分離純化的難度[47]。張茜茜等對吸水鏈霉菌井岡變種進行了 60Co γ射線、亞硝酸-紫外和紫外復合誘變，經過逐級誘變篩選出一株高產菌株F-101，該菌株的代謝產物井岡霉素A組分含量比原菌株高33.5%[48]。

3.2 固定化技術

固定化微生物技術于20世紀80年代興起，是一種具有良好發展前景的新型生物技術，有利于提高生物反應器內微生物細胞濃度和純度、保持高效菌種、二次污染小等。朱祥瑞等用蠶絲為載體材料通過吸附和交聯方法制備成固定化鏈霉菌，其活性比游離鏈霉菌高，適應范圍廣[49]。用微生物固定化細胞方法生產生物工程產品早已有報道，從海底泥分離的灰棕褐鏈霉菌（p-33）產生α，β-不飽和γ-內酯類抗生素，將其固定在硅藻土中進行發酵，其抗菌活性提高2倍，抗生素產量提高2.6倍。朱啟忠等研究了鏈霉菌Strz-2木聚糖酶被固定化后的酶活性變化情況，結果發現固定化酶優于原酶[50]。Ibrahim將海藻酸鈣固定化細胞作為生物催化劑，結果表明固定化細胞的鏈霉菌對抗微生物病原體更有效[51]。

3.3 發酵工藝

發酵可以使鏈霉菌富集，從而獲取大量防治植物病害的活性物質。為了讓鏈霉菌更好發揮生防作用，優化鏈霉菌的發酵工藝顯得十分有意義。邱立友等將鏈霉菌A048采用幾丁質和纖維素雙因子誘導二步發酵，產生的幾丁質酶活性比只加幾丁質誘導的高4倍[52]。駱健美等用最陡爬坡路徑、中心旋轉組合設計及響應面分析方法得到褐黃孢鏈霉菌納他霉素發酵條件較佳的試驗點，與原始培養條件相比，納他霉素產量提高了2倍[53]。Adinarayana等優化了生產新霉素的弗氏鏈霉菌半固態發酵，新霉素含量可達250 μg/mL[54]。劉薇等進行了串珠霉與鏈霉菌2株菌株混合協同互助發酵產纖維素酶，使得纖維素酶比優化前提高了111～5.57倍[55]。

3.4 核糖體工程

核糖體工程是通過對核糖體和 RNA 聚合酶進行修飾和改造，激活細胞自身潛能，可引入特定的抗生素抗性突變，篩選出高效抗性突變株，提高次級代謝產物產量，可用于鏈霉菌生物合成潛能的提高及其他性狀的改良。Ochi提出了核糖體工程育種技術的概念[56]。Shima等發現，向變鉛青鏈霉菌核糖體中引入某些點突變，會顯著提高放線菌紫紅素的產生量[57]。李曉玲等應用核糖體工程技術對白淺灰鏈霉菌進行改造，豐富了白淺灰鏈霉菌次生代謝產物的結構多樣性，探索了天然產物資源有限的問題[58]。

3.5 基因工程

隨著現代生物技術發展，以基因工程為核心的菌種改良方法有望發展成為定向改良現有微生物殺菌劑性能和降低生物農藥生產成本的主導技術。通過基因工程可以激活抗生素的沉默基因獲得新的抗生素，改良抗生素的生產菌等。張桂敏等將透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）克隆到含鏈霉菌ФC31噬菌體整酶，attP基因的誘導型表達載體pIJ8600上，pHZl276通過接合轉移導入變鉛青鏈霉菌，vgb基因在該菌中表達出有活性的VHb蛋白，從一定程度上解決了鏈霉菌發酵中的溶氧問題，提高了抗生素產量[59]。日本學者Hotta等通過將灰色鏈霉菌和天神島鏈霉菌種間基因組重排，篩選到一種完全不同于親株的非氨基糖苷類抗生素吲哚佐霉素[60]。Zhang等運用基因工程快速提高弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力[61]。廖國建等通過增加相關關鍵酶基因（sanU、sanV、sanG）的拷貝數成功提高尼可霉素的產量[62]。Mazodier等于1989年通過接合轉移的方法把質粒DNA從大腸桿菌轉移到變鉛青鏈霉菌中，實現了質粒在大腸桿菌和鏈霉菌之間的跨屬轉移[63]。

4 存在的問題及展望

鏈霉菌在生物防治和環境保護領域具有重大應用前景，是許多病原微生物的生防因子，也是目前研究應用廣泛的生防菌。隨著鏈霉菌研究的不斷擴展和深入，相信會有更多鏈霉菌被篩選，進而豐富我國的鏈霉菌種群及其系統分類學研究。篩選優良菌株或利用基因工程技術和原生質體融合技術，為構建高產、高效鏈霉菌的生防菌株防治植物病害等提供有力的保障。盡管鏈霉菌在生物防治中取得了一定的成就，但從整體上看還存在一些問題。例如，病原物對抗生素的耐藥性增強，使得新抗生素的數量呈直線下降趨勢發展[64]；大多數生防鏈霉菌篩選都是在試驗的條件下進行的，沒有進行田間試驗，而在田間自然條件下生防菌株的生防能力也會有所變化，防效不穩；鏈霉菌中許多的功能物質、定殖規律和作用機理不明確，影響其發揮作用，而鏈霉菌能否成功定殖在植物葉表面和根部形成優勢種群，是其大規模商品化應用于農業上的一個關鍵因子[65-66]。有研究表明，環境中的溫度、濕度、天氣等都會影響鏈霉菌在植物表面和土壤中的定殖、繁殖和擴展情況。endprint

今后研究可以包括以下方面：（1）采用現代發酵工程和代謝工程技術研究微生物定向發酵調控工藝。建立優化的發酵、增殖生產工藝技術，提高有效活性物質的生產率。（2）用抗病機制有交叉的生防菌復配協同抗病。許多學者的研究表明，使用幾種拮抗菌的混合物可以獲得良好的病害防治效果[67-68]，多菌復配可以拓寬鏈霉菌使用范圍，防治多種病原菌；可以增強其有效性，減少使用頻率，可結合不同微生物的防治優勢，提高生防效果。（3）通過對鏈霉菌的遺傳改良包括提高抗菌物質的表達增強競爭能力和誘導抗性等，增強其抗菌活性，擴大抑菌譜，增強在植物寄主上的定殖能力，從而提高防病能力。隨著現代生物技術的運用，鏈霉菌的研究及開發應用將會出現新的發展，對農業的可持續發展具有重要意義，同時有較強的市場競爭力和良好經濟效益，能產生巨大的社會、經濟和生態效益，將會有廣闊的應用前景。

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