新城疫病毒LaSota疫苗株的準種遺傳變異分析

吳雙等

摘要：為開展新城疫病毒（NDV）LaSota疫苗株的反向遺傳操作技術研究，了解該病毒的準種分化情況，運用雞胚極限稀釋法對NDV LaSota疫苗株進行傳代純化，選擇病毒稀釋度最高、血凝價較高的雞胚尿囊液作為傳代接種物，傳至第5代，RT-PCR擴增序列，測定并分析其全基因組序列，闡述LaSota疫苗株準種分化情況，為基因工程疫苗的研制奠定了一定基礎。

關鍵詞：新城疫病毒；LaSota疫苗株；準種；極限稀釋法

中圖分類號： S852.65+7 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0161-03

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）強毒株引起的一種禽類致死性傳染病，是當今世界上危害最大的家禽傳染病之一[1-4]，被國際獸疫局（OIE）列為必須呈報的疫病之一。該病最常侵襲雞和火雞，至少250種鳥類可自然或實驗室感染NDV，且強毒感染能對其造成100%的死亡率[5]。NDV屬于副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，其基因組由單股負鏈RNA構成，基因組結構為 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次編碼6種結構蛋白：核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L），其中病毒囊膜表面的2種糖蛋白F和HN是構成NDV致病性的主要分子基礎[6]。對于ND疾病的控制，在發達國家以捕殺強毒感染群為主，同時結合疫苗接種，而在廣大發展中國家疫苗接種仍是控制該病的主要手段。NDV經典弱毒疫苗毒株LaSota具有抗體提升快、繁殖性能良好、免疫原性好、抗體效價高、遺傳穩定性好等優勢，被世界各國廣泛應用于雛雞免疫。然而，在長達近百年的使用過程中，LaSota毒種被反復雞胚傳代，準種分化嚴重。準種是由Eigen在1971年提出的用于描述同種生物遺傳異質性的概念[7]，感染個體內同種病毒的遺傳異質性是RNA病毒具有的一種普遍的生物學特性，實際上是由一系列基因序列相近而又不完全相同的突變體構成的。準種是病毒基因組突變或重組的結果，是連續的遺傳變異、競爭和選擇所產生的[8]。

本研究使用SPF雞胚極限稀釋法對筆者所在實驗室保存的NDV LaSota病毒株進行純化，測定其全基因組序列，以揭示該毒株的準種遺傳變異，這對后續開展該毒株的反向遺傳學研究具有重要意義，也為基因疫苗的研制奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒和雞胚

LaSota株和NDV陽性血清購自中國獸醫藥品監察所，由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室保存。SPF種蛋購自山東家禽研究所SPF雞場，由本室孵化至所需日齡。

1.2 常用分子生物學試劑和分子生物學軟件

Trizol抽提試劑購自Invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒、大腸桿菌（Escherichia coli）菌種DH5α感受態細胞、質粒小提試劑盒購自天根生物有限公司；X-Gal、IPTG、dNTPs、6 nt 隨機引物等購自寶生物工程（大連）有限公司；高保真聚合酶2×LAmp MasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司；EcoRⅠ、DNA Markers購自Fermentas生物工程有限公司；禽白血病反轉錄酶、RNA 酶抑制劑、pGEM-T easy 載體vector和瓊脂糖購自Promega公司；焦碳酸二乙酯購自AMRESCO公司；蛋白棟和酵母提取物購自英國OXOID公司；飽和酚、三氯甲烷、異丙醇等常規試劑購自生工生物有限公司；其余試劑均為國內分析純；磷酸鹽緩沖液（PBS）、1%雞紅細胞按OIE標準方法自制。Primer Premier 5.0和DNAStar 4.0版本軟件包中的分析軟件有DNASTAR Inc. Madison、WI153715，USA。

1.3 NDV LaSota株復壯和增殖

取-80 ℃保存的LaSota種毒，室溫融化，用無菌PBS進行10-6稀釋，按0.2 mL/胚接種到9～11日齡SPF雞胚上，37 ℃ 孵育，每12 h觀察1次，觀察120 h。棄去24 h內死亡的雞胚，將24 h以后死亡及120 h以后未死亡的雞胚置于 4 ℃ 冰箱中過夜，收集尿囊液，單胚單收，逐個測定每胚尿囊液的血凝價（HA效價），從所收獲的尿囊液中挑選HA效價高的尿囊液，保存于-80 ℃冰箱。HA試驗按OIE 標定的β微量法進行。

1.4 NDV LaSota株純化和篩選

毒種純化采用雞胚極限稀釋法，將HA效價高的尿囊液作10倍系列稀釋至10-10，然后取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等5個連續稀釋度的尿囊液，按0.1 mL/胚接種到9～11日齡SPF雞胚上，每個稀釋度接種雞胚5枚，接種后置于 37 ℃ 溫箱孵育，逐個收獲24～120 h死亡雞胚及120 h 后存活雞胚的尿囊液，無菌操作，單胚單收，分別測定每個雞胚尿囊液的血凝價。同時，根據Reed-Muench法計算雞胚半數感染量（EID50）。選擇病毒稀釋度最高、血凝價 HA 較高的雞胚尿囊液作為傳代接種物，按上述方法進行，繼續病毒接種傳代。

1.5 引物設計與合成

參考GenBank中NDV LaSota的全基因組序列，利用Premier 5.0設計10對引物，相鄰擴增片段之間有50～200 nt核酸序列相互重疊，拼接起來可以覆蓋NDV全基因組。引物序列見表1，引物均由上海Invitrogen公司合成。

測序比對結果表明，純化株與原病毒株在基因序列上并沒有太大差異，HN蛋白氨基酸突變率最高，為0.29%，M蛋白和F蛋白沒有突變，說明該純化株仍為LaSota病毒株，沒有在篩選傳代的過程中發生根本變異。

將此純化株分別與GenBank上的LaSota（登錄號分別為AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因組序列相比，核苷酸的同源性分別為99.2%、99.0%和99.6%，突變主要集中在L和HN蛋白上。3 結論與討論

準種是同一株病毒在宿主體內表現為一群系統發育密切相關的變異株，它是由一定數量核苷酸相同的優勢準種和序列互不相同的劣勢準種組成的。RNA依賴的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使復制中產生的錯誤未能校正、宿主本身的選擇（正選擇作用）和病毒基因組結構的限制（負選擇作用）3種機制會導致優勢準種不固定，在一些外界選擇壓力作用下，劣勢準種甚至可替代優勢準種。

為了更好地開展該毒株的反向遺傳操作技術研究，在病毒純化過程中，有必要進行幾個病毒克隆株的篩選，以獲得一株能代表絕大多數病毒克隆株性質的克隆株。首先，在病毒傳代過程中考慮到疫苗制備需要，每次應選擇病毒稀釋度最高、血凝價較高的尿囊液作為傳代接種物；其次，擴增基因片段時選擇高保真聚合酶，PCR循環數設為25次；最后，為避免PCR 過程可能造成基因的變異以及測序過程中可能帶來的突變，對該病毒基因片段至少測序5個陽性克隆，綜合多次測序結果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應該能夠真實反映該病毒株基因組的核苷酸序列。

純化株序列與種毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比較，結果發現核苷酸發生變異，表明該疫苗株是在自然界的選擇壓力與免疫壓力下對外界環境變化而發生的一種適應性突變。NDV囊膜表面的F和HN等2個糖蛋白容易經受選擇壓力的作用，同時也是構成NDV主要致病性的分子基礎[10]。Peeters 等在1999年發現尤其是F蛋白在NDV致病過程中發揮著重要作用[2]。然而，鞏艷艷等在2009年抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因，認為HN基因的變異更能代表NDV 的進化規律和趨勢[11]。筆者發現F蛋白沒有發生突變，而HN蛋白的突變率最高，堿基突變率達到了0.29%，與鞏艷艷等的研究結果[11]一致。本研究結果在一定程度上也表明NDV的進化是多個基因包括調控區共同演化的結果。

參考文獻：

[1]于 洋，封振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子機制研究進展[J]. 江蘇農業學報，2013，29（2）：435-439.

[2]梁淑珍，郭 兵，王海風. 中藥復方對雞新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 江蘇農業科學，2012，40（2）：176-178.

[3]段志強，胡 嬌，胡增壘，等. 鵝源新城疫病毒M基因的原核表達及其多克隆抗體制備[J]. 江蘇農業學報，2012，28（1）：125-130.

[4]魏 寧，桂文龍，李巨銀，等. 新城疫疫苗及免疫程序對蛋雞免疫效果的研究[J]. 江蘇農業科學，2012，40（11）：232-234.

[5]Qiu X，Sun Q，Wu S，et al. Entire genome sequence analysis of genotype IX newcastle disease viruses reveals their early-genotype phylogenetic position and recent-genotype genome size[J]. Virology Journal，2011，8：117.

[6]Peeters B H，de Leeuw O S，Koch G，et al. Rescue of NDV from cloned cDNA：evidence that cleavability of fusion protein is a major determinant for virulence[J]. Virology Journal，1999，73（6）：5001-5009.

[7]Eigen M. Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules[J]. Naturwissenschaften，1971，58（10）：465-523.

[8]Kissi B，Badrane H，Audry L，et al. Dynamics of rabies virus quasispecies during serial passages in heterologous hosts[J]. Journal of General Virology，1999，80（8）：2041-2050.

[9]Liu X，Wang X，Wu S，et al. Surveillance for avirulent newcastle disease viruses in domestic ducks （Anas platyrhynchos and Cairina moschata） at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated[J]. Journal of the W V P A，2009，38（5）：377-391.

[10]aldous E W，Mynn J K，Banks J，et al. A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1（newcastle disease virus）isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene[J]. Journal of the W V P A，2003，32：239-257.

[11]鞏艷艷，崔治中. 細胞培養上新城疫病毒HN基因在抗體免疫選擇壓作用下的抗原表位變異[J]. 中國科學，2009，39（12）：1175-1180.

將此純化株分別與GenBank上的LaSota（登錄號分別為AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因組序列相比，核苷酸的同源性分別為99.2%、99.0%和99.6%，突變主要集中在L和HN蛋白上。3 結論與討論

準種是同一株病毒在宿主體內表現為一群系統發育密切相關的變異株，它是由一定數量核苷酸相同的優勢準種和序列互不相同的劣勢準種組成的。RNA依賴的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使復制中產生的錯誤未能校正、宿主本身的選擇（正選擇作用）和病毒基因組結構的限制（負選擇作用）3種機制會導致優勢準種不固定，在一些外界選擇壓力作用下，劣勢準種甚至可替代優勢準種。

為了更好地開展該毒株的反向遺傳操作技術研究，在病毒純化過程中，有必要進行幾個病毒克隆株的篩選，以獲得一株能代表絕大多數病毒克隆株性質的克隆株。首先，在病毒傳代過程中考慮到疫苗制備需要，每次應選擇病毒稀釋度最高、血凝價較高的尿囊液作為傳代接種物；其次，擴增基因片段時選擇高保真聚合酶，PCR循環數設為25次；最后，為避免PCR 過程可能造成基因的變異以及測序過程中可能帶來的突變，對該病毒基因片段至少測序5個陽性克隆，綜合多次測序結果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應該能夠真實反映該病毒株基因組的核苷酸序列。

純化株序列與種毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比較，結果發現核苷酸發生變異，表明該疫苗株是在自然界的選擇壓力與免疫壓力下對外界環境變化而發生的一種適應性突變。NDV囊膜表面的F和HN等2個糖蛋白容易經受選擇壓力的作用，同時也是構成NDV主要致病性的分子基礎[10]。Peeters 等在1999年發現尤其是F蛋白在NDV致病過程中發揮著重要作用[2]。然而，鞏艷艷等在2009年抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因，認為HN基因的變異更能代表NDV 的進化規律和趨勢[11]。筆者發現F蛋白沒有發生突變，而HN蛋白的突變率最高，堿基突變率達到了0.29%，與鞏艷艷等的研究結果[11]一致。本研究結果在一定程度上也表明NDV的進化是多個基因包括調控區共同演化的結果。

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將此純化株分別與GenBank上的LaSota（登錄號分別為AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因組序列相比，核苷酸的同源性分別為99.2%、99.0%和99.6%，突變主要集中在L和HN蛋白上。3 結論與討論

準種是同一株病毒在宿主體內表現為一群系統發育密切相關的變異株，它是由一定數量核苷酸相同的優勢準種和序列互不相同的劣勢準種組成的。RNA依賴的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使復制中產生的錯誤未能校正、宿主本身的選擇（正選擇作用）和病毒基因組結構的限制（負選擇作用）3種機制會導致優勢準種不固定，在一些外界選擇壓力作用下，劣勢準種甚至可替代優勢準種。

為了更好地開展該毒株的反向遺傳操作技術研究，在病毒純化過程中，有必要進行幾個病毒克隆株的篩選，以獲得一株能代表絕大多數病毒克隆株性質的克隆株。首先，在病毒傳代過程中考慮到疫苗制備需要，每次應選擇病毒稀釋度最高、血凝價較高的尿囊液作為傳代接種物；其次，擴增基因片段時選擇高保真聚合酶，PCR循環數設為25次；最后，為避免PCR 過程可能造成基因的變異以及測序過程中可能帶來的突變，對該病毒基因片段至少測序5個陽性克隆，綜合多次測序結果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應該能夠真實反映該病毒株基因組的核苷酸序列。

純化株序列與種毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比較，結果發現核苷酸發生變異，表明該疫苗株是在自然界的選擇壓力與免疫壓力下對外界環境變化而發生的一種適應性突變。NDV囊膜表面的F和HN等2個糖蛋白容易經受選擇壓力的作用，同時也是構成NDV主要致病性的分子基礎[10]。Peeters 等在1999年發現尤其是F蛋白在NDV致病過程中發揮著重要作用[2]。然而，鞏艷艷等在2009年抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因，認為HN基因的變異更能代表NDV 的進化規律和趨勢[11]。筆者發現F蛋白沒有發生突變，而HN蛋白的突變率最高，堿基突變率達到了0.29%，與鞏艷艷等的研究結果[11]一致。本研究結果在一定程度上也表明NDV的進化是多個基因包括調控區共同演化的結果。

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